具有甲状腺素5'脱碘酶活力抗体酶的制备
本发明属于具有甲状腺素５’脱碘酶活力抗体酶的制备方法。该方法以甲状腺素为半抗原，通过共价交联的方法，与牛血清白蛋白连接，制备成全抗原，采用单克隆抗体技术，制备具有甲状腺素结合能力的抗体，通过化学修饰，将甲状腺素脱碘酶的催化中心－ＳｅＨ引入到抗体的抗原结合部位，赋予其甲状腺素脱碘酶的活性。制得的抗体酶稳定性好，活力达２９０Ｕ／ｍｇＰｒ。
发明专利
CN99121250.9
1999-10-22
CN1294192
2001-05-09
C12N9/00
中国科学院长春应用化学研究所
赵大庆;陈默;廉革伟;林凤;丁兰;刘仔;倪嘉缵
130022吉林省长春市人民大街159号
中国科学院长春专利事务所
曹桂珍
吉林;22
权利要求书1．一种具有甲状腺素5’脱碘酶活力抗体酶的制备方法，其特征在于采用以下步骤完成：A．全抗原的制备将T4与牛血清白蛋白以30-50∶l(摩尔比)的比例溶解于pH8-ll的Tris-HCl缓冲液中，其中，T4浓度为1-5mg／ml搅拌，逐渐滴加戊二醛，反应10-24小时，加入甘氨酸终止反应，除盐，冻干；B．单克隆抗体的制备a．免疫小鼠将抗原1-3mg／ml与福氏完全佐剂1∶1混合，摇匀，每只Bab／c小鼠注射100-300μl，两周后进行二次免疫，第四到十周每隔两周以福氏不完全佐剂免疫，用ELISA检测抗体；b．融合及抗体制备拉颈法处死小鼠，取脾脏，无菌条件下在预先放置培养液的平皿中去除脂肪组织，压碎，吸取细胞悬液，离心，弃上清，用完全培养液反复洗涤，得到0．5-1．5×108个脾细胞，加入0．1-0．5倍数量的骨髓瘤细胞，混合，离心，弃去上清的培养液，吸取1ml聚乙二醇(PEG)／二甲亚砜(DMSO)加入细胞中，混合1分钟；将含有PEG的细胞悬液反复洗涤，加入选择培养基，在培养板上37度、5％二氧化碳浓度下培养，一周后镜检，对明显的细胞集落孔进行ELISA，取阳性孔梯度稀释，扩大培养，进行初次克隆化，1反复克隆化3-5次，获得单细胞克隆，将0．5-1．5×106的杂交瘤细胞注入Bab／C小鼠腹腔或采用体外培养法，在培养瓶中，得到腹水或培养上清；c．分离提纯抗体将腹水或体外细胞培养液离心，取上清采用亲和层析或离子交换柱提纯抗体，冻干；C．抗体酶的制备将提纯的抗体冻干粉5-10mg溶解在1ml除氧的pH6-8的磷酸缓冲液中，加入10-30μl 20mg／ml的苯甲基磺酰氟的乙腈溶液，室温振荡0．5-1小时，加入50-200μl预先除氧的1MNaHSe溶液，30-40度，在氮气保护下反应20-40小时，将反应液离心，除盐后冻干，制得抗体酶冻干粉。