犬细小病毒的PCR检测方法
本发明提供一种犬细小病毒的ＰＣＲ检测方法，本发明的内容包括一套由ＰＣＲ试剂管、阳性对照、阴性对照、Taq酶、普通琼脂糖、溴化乙锭溶液、溴酚兰上样缓冲液组成的ＰＣＲ检测试剂盒以及一套检测操作程序。本发明突出的优点是建立起一套标准方法，可快速、准确地检测出供检样品中的犬细小病毒，可应用于对实验动物犬的质量监测，也为宠物犬和军犬、肉用犬等各种犬的疾病诊断提供简单快速准确的方法。
发明专利
CN99117264.7
1999-12-02
CN1298025
2001-06-06
C12Q1/68
广东省昆虫研究所
刘忠华;钟翎
510260广东省广州市新港西路105号
中国科学院广州专利事务所
余炳和
广东;44
1．一种犬细小病毒的PCR检测方法，其特征在于：(一)设置PCR检测试剂盒，该试剂盒包括：(1)PCR试剂管，试剂管内含10×buffer，dNTP，引物1和引物2，<chemistry-cwu><chem><cml><molecule>MgCl<sb>2</sb></molecule></cml></chem></chemistry-cwu>，所述的引物1和引物2分别是由DNA合成仪按碱基序列为5’TACCATGGTACAGATCCAG3’和5’CTCCTATATCACCAAAGTTA3’合成的DNA片段；(2)阳性对照，该对照为经CTAB消化，酚氯仿抽提的犬细小病毒DNA模板；(3)阴性对照，该对照为不含犬细小病毒并经热处理的粪样；(4)Taq酶；(5)普通琼脂糖；(6)溴化乙锭溶液；(7)溴酚兰上样缓冲液；(二)按照以下操作规程进行检测；(1)样品处理粪样+灭菌生理盐水或PBS(PH7.2)，充分振荡后，离心去沉淀，取上清放入另一支灭菌离心管中，隔水煮沸使蛋白质变性，放入冰水降温后离心去沉淀，吸取上清放入另一离心管中保存备用；(2)PCR在PCR试剂管中加入经稀释的样品，同时设阴阳性对照，稍离心，94～96℃变性，每管加入Taq酶不少于0.3μl，稍离心混匀，置PCR仪进行扩增，PCR反应循环条件：采用降落(TD)PCR程序；(3)扩增产物分析将琼脂糖溶于电泳缓冲液，把温热凝胶倒入放好梳子的胶膜中，凝胶凝固后，移去梳子，将凝胶放入有电泳缓冲液的电泳槽，将样品扩增产物与溴酚兰上样缓冲液混合，用微量移液器将样品依次加入加样孔内，盖上电泳槽并通电60～100V恒压电泳，使DNA向阳极方向移动，电泳完成后，切断电源，取出凝胶，将此凝胶经溴化乙锭溶液浸泡后取出，放在透射紫外灯下观察，将样品孔出现的电泳带比对阳性对照和阴性对照，以判定样品为犬细小病毒阳性或阴性。