高产长链二元酸的假丝酵母的筛选方法
本发明涉及高产长链二元酸的假丝酵母的筛选方法，首先采用硫酸二乙酯诱变假丝酵母，然后用紫外线二次诱变酵母细胞及氯丙嗪浓缩α、ω－氧化增强的假丝酵母，用培养基系统筛选α、ω－氧化增强的假丝酵母，最后获得α、ω－氧化增强的假丝酵母。使用本发明的方法可以快速地分离获得目的菌株，使α、ω－氧化增强型菌株快速的从大量的处理细胞中分离出来，从而为提高长链二元酸的产酸量和转化率打下基础。
发明专利
CN99107779.2
1999-05-28
CN1233658
1999-11-03
C12N1/14
清华大学
曹竹安; 焦鹏; 朱涛; 林荣胜; 黄英明
100084北京市海淀区清华园
清华大学专利事务所
罗文群
北京;11
1． 一种高产长链二元酸的假丝酵母的筛选方法，其特征在于，该方法由以下步骤组成：（1）、首先采用硫酸二乙酯诱变假丝酵母：从菌体的固体平板上挑取假丝酵母、的单菌落，接种于装有20－30毫升麦芽汁培养基的300毫升的三角瓶中，在28－35℃的温度下于150－300转／分钟的摇床上培养24－48小时：将发酵菌液在离心机中2000－8000转／分离心3－10分钟，弃去上清液，用无菌水重新悬浮细胞，使细胞浓度达到1－8×108个／毫升：将上述菌液1－3毫升分装于5毫升的离心管中， 2000－8000转／分钟离心3－10分钟，弃去上清液，用1－3毫升的pH7．0的0．IM的磷酸钠缓冲液重新悬浮细胞，混匀，吸取0．1－0．5毫升放置于4℃冰箱中作为对照；在剩余的的菌液中加入1－3％体积的硫酸二乙酯，混匀，在30℃的温度下于150－300转／分钟的摇床上处理20－60分钟，然后加入200－600μl的25％硫代硫酸钠，混匀，终止反应：将处理液在离心机上3000－6000转／分钟离心4－10分钟，沉淀细胞：（2）、制备固体平板1，其组成为：酵母浸膏粉： 10g／L，蛋白胨： 20g／L，葡萄糖： 20g／L，制备培养基1，其组成为：磷酸二氢钾：4g／L，葡萄糖： 10g／L，磷酸氢二钠：2g／L，氯化钠：1g／L，酵母膏：1g／L，维生素B1：0．1／L，尿素：2G／L，烷烃： 20g／L； pH7．5，加入1－3％的8．3g／L浓度的酚红，制备培养基2：磷酸二氢钾：4g／L，葡萄糖： 10g／L，磷酸氢二钠：2g／L，氯化钠：1g／L，酵母膏：1g／L，维生素B1：0．1g／L，尿素：2g／L，烷烃：20g／L； pHl0．5，加入1－3％的10g／L浓度的百里香兰酚酞乙醇溶液，备用：（3 ）、紫外线二次诱变酵母细胞及氯丙嗪浓缩α、w－氧化增强的假丝酵母：将上述沉淀细胞用无菌水稀释至10－2－10－4，从中取0．1－0．4毫升稀释液分别涂于含有1－5毫克／升的氯丙嗪的固体平板1以及不合氛丙嗪的固体平板上，每个稀释度涂3－6个平板，紫外灯预热20到30分钟，以1－5×l05J／mm2的计量处理上述平板，同时，设置不用紫外线处理的对照，平板处理完毕后，避光，在3O－37℃培养48－120小时；（4）、培养基系统筛选α、w－氧化增强的假丝醉母：经过3处理的平板，选择致死率为5－90％且在含有氯丙嗪的培养基的条件下获得生长的菌株，分别一一对应的接种于培养基1和培养基2的平板上，在30－37℃培养120－168小时；（5）、α、w-氧化增强的假丝酵母的获得：经过4处理的菌株，首先，测定不同菌株在培养基2平板上的R值，选择R值大的苗株作为目的菌株，观察菌株的菌落在培养基2平板上的变色圈，选择其中显示黄色的茵株，结合在培养基1平板和培养基2平板上的情况，将在培养基1上显示黄色和R值大的菌株筛选出来，即为本发明的α、w－氧化地强的假丝酵母。