多拷贝基因在霉菌中的定点整合方法

摘要：

提出一种在霉菌中定点整合一个基因多拷贝的方法，其中包括用一段包含至少是编码目的蛋白的一个结构基因的至少一个表达性基因的多个拷贝的DNA片段转化一种霉菌细胞，该霉菌细胞的染色体DNA中含有稀有切点的内切酶限制性切点，如I－SceI，优选导入到预期位点，如在选择性标记基因内部或与之相邻，转化所用的DNA片段位于两段与所述限制性位点的上下游及相邻序列同源的片段之间，在转化过程中使用稀有切点的内切酶，然后选择或筛选霉菌染色体DNA中插入所述表达性多基因拷贝的霉菌细胞。所述DNA片段还包含第三段DNA,该DNA能够使染色体上破裂或部分缺失的选择性标记基因完整。优选的霉菌包括曲霉属，尤其是泡盛曲霉。还提出一种通过本发明方法获得的转化霉菌及培养该转化霉菌的方法，生产和可选可不选地分泌目的蛋白的方法，该方法是在一定条件下培养转化霉菌使编码目的蛋白的基因表达，以及可选可不选地分离或浓缩目的蛋白的方法。

专利类型：发明专利

申请/专利号：CN98813762.3

申请日期：1998-10-06

公开/公告号：CN1284998

公开/公告日：2001-02-21

主分类号：C12N15/80

申请/专利权人:尤尼利弗公司

发明/设计人:M·J·A·德格鲁特;A·G·M·贝杰斯伯根;W·穆斯特斯

主申请人地址:荷兰鹿特丹

专利代理机构:中国专利代理(香港)有限公司

代理人:卢新华%王其灏

国别省市代码:荷兰;NL

权利要求：

权利要求书1．一种在霉菌中定点整合基因多拷贝的方法，该方法包括：(ⅰ)提供一种霉菌细胞，其中在其染色体DNA中含有稀有内切酶的限制性位点，(ⅱ)用一种DNA转化该霉菌细胞，所说DNA按照5’到3’方向顺序含：(a)第一段DNA片段，与霉菌染色体DNA中所含的稀有切点的内切酶限制性位点的上游部分和相邻的DNA同源，(b)至少一个表达性基因的多拷贝，其中含有编码目的蛋白的结构基因，(c)第二段DNA片段，与霉菌染色体DNA中所含的稀有切点的内切酶限制性位点的下游部分和相邻的DNA同源，在霉菌转化过程中，提供了稀有切点的内切酶，(ⅲ)筛选或检出所说表达基因多拷贝被插入到霉菌染色体DNA中的霉菌细胞。