人胰岛素原的制备方法
本发明涉及化学式（Ⅰ）代表的人胰岛素原的制备方法，其中R是可以被酶解或化学降解的氨基酸残基或肽；倘若从A－1到A－21的区域是胰岛素A链，从B－1到B－30的区域是胰岛素B链，X就是胰岛素A链A－1氨基和胰岛素B链B－30羧基之间的键，其可以被酶或化学法从A链或B链中分开。按照本发明，人重组胰岛素前体可以具备良好重现性地方便生产，因为溶解、磺化、浓缩、脱盐和纯化被大大简化，同时重折叠反应的产率增高。
发明专利
CN98812757.1
1998-12-24
CN1290299
2001-04-04
C12N15/17
株式会社钟根堂
洪清一;金正优;李旺植;金昌圭;金容麟;夫济泥;申政∴;吴成珍
韩国汉城市
中原信达知识产权代理有限责任公司
丁业平%王维玉
韩国;KR
权利要求书1．一种制备人胰岛素原的方法，包括以下步骤：(i)将表达内含体形式的胰岛素原融合蛋白质的大肠杆菌细胞悬浮于缓冲液中，溶解所述细胞以得到内含体；(ii)将步骤(i)中得到的所述内含体悬浮于含有变性剂的缓冲液中，同时用亚硫酸钠和连四硫酸钠磺化所述的胰岛素原融合蛋白质，得到如下列通式(II)所代表的胰岛素原S-磺酸盐融合蛋白质；(iii)将步骤(ii)得到的胰岛素原S-磺酸盐融合蛋白质离心，得到沉淀，将沉淀溶解于甲酸，然后通过用溴化氰处理从所述融合蛋白质切下胰岛素原S-磺酸盐，然后在减压下干燥；(iv)使步骤(iii)得到干燥的胰岛素原S-磺酸盐溶解于缓冲液，在阴离子交换色谱上纯化所述胰岛素原S-磺酸盐；(v)将步骤(iv)得到的所述纯化的胰岛素原S-磺酸盐稀释于第一缓冲液，通入氮气以排除氧气而得到第一混合物，将第一混合物与含有2-巯基乙醇的第二缓冲液在混合池中混合，并在储库中搅拌，得到含有如下列通式(I)所代表的胰岛素原的重折叠反应混合物；和(vi)将步骤(v)得到的重折叠反应混合物应用于吸附色谱树脂，用水溶液洗脱，得到重折叠的人胰岛素原，1其中，R是可以被酶或化学降解的氨基酸残基或肽；和倘若从A-1到A-21的区域是胰岛素的A链，从B-1到B-30的区域是胰岛素的B链，X则是胰岛素A链A-1氨基和胰岛素B链B-30羧基之间的键，其可以被酶或化学法从A链或B链中分离。2