A型肉毒结晶毒素的生产工艺及生产该毒素所需的冻干保护液
本发明涉及微生物毒素，所得制品属新的生物制品，主要用于神经科、眼科等领域的肌张力障碍性疾病如：眼睑痉挛、面肌痉挛、斜视及痉挛性斜颈等的治疗。其工艺为：产毒培养基－产毒培养－除菌过滤－毒素的精制提纯－毒素的稀释、冻干。利用本发明制取的制品具有毒素收获率高、质量好、有效期长、价格低等优点。
发明专利
CN97118838.6
1997-10-18
CN1215084
1999-04-28
C12P21/00
卫生部兰州生物制品研究所
王荫椿
730046甘肃省兰州市盐场路118号
甘肃省专利服务中心
徐筱梅
甘肃;62
1、一种1型肉毒结晶毒素的生产工艺，其特征在于。1、产毒培养基成份酪蛋白胰酶消化液 50％酵母透析液 N％蒸馏水 3】％葡萄糖 1、1 1％其中，酪蛋白胰酶消化液成份酪蛋白 卜【 10h蒸馏水 门M叫胰酶粉（活力单位L门1以上门，1活力单位J！酪蛋白11、产毒培养基形成①、将酪蛋白胰酶消化液与蒸馏水混合，加热N一N℃，用26％氢氧化钠溶液调正H人1，煮开后加入酵母透析液，再煮M分钟，用N％氢氧化钠再调H至调1；②、煮沸，滤纸过滤，分装立瓶， ＋ii3”CN分钟灭菌备用。③、另配M％葡萄糖溶液于113”CN分钟灭菌，接种时用；m。产毒培养将经过适应培养后的1型肉毒梭菌HaL［株j菌种，接种干H．M】一35．M0tl的产毒培养基中， 35”C培养i天；w。除菌过滤经镜检为纯培养后，用无石棉除菌板或除菌滤膜过滤，得原毒素液，用小白鼠测定毒力，毒力应在M‘H、叫左右。V。毒素的精制提纯①。酸沉淀：原毒素液加六偏磷酸钠，使最终浓度达1．】％，用】当量盐酸调M至】．j左右，：一1℃过夜；②、毒素提取：弃上清，沉淀用蒸馏水洗1次，加适量HL】、LN磷酸盐缓冲液，分两次溶解。提取，每次置室温卜、时，离心后分别取上清液合并之；（3）、酶处理及浓缩：提取液按100ug／ml加入核糖核酸酶，35℃温育3小时，加硫酸铵至60％饱和，2一8℃过夜，离心，沉淀用适量PH5．5、0．05N柠檬酸缓冲液溶解后，透析：（4）、层析：透析液经OEAE一A50离子交换层析，收集、合并OO260－OO280为0．5一0．6的过柱液；（5）、结晶：合并液加硫酸铵至60％饱和，2一8℃过夜，离心．沉淀用适量PH6．8、0．05N磷酸盐缓冲液溶解，再在含0．9N硫酸铵的上述缓冲液中透析，自然形成结晶，亦可重复上述过程，以形成第二次结晶；VI、毒素的稀释、冻干（1）、稀释a、用磷酸盐缓冲液溶解及透析结晶毒素，除菌过滤后测定毒力；b、用磷酸盐缓冲液将已知毒力的毒素溶液稀释至适当依度（105一106lO50／ml；c、将适量的稀释毒素力加入到定量的冻干保护液中，使每毫升冻干保护液中毒素含量在效价要求的范围（50一100LO50／ml）；②、分装、冻干每安瓶定量分装上述含冻干保护液的毒素稀释液1毫升，以蛋白质制品的冻干曲线对其进行冻干，冻干成品应无菌、水份含量不超过3％。