Cas9蛋白、含有Cas9蛋白的基因编辑系统及应用
本发明属于基因编辑技术领域，具体涉及一种CRISPR/Cas9基因编辑系统以及其应用。本发明基因编辑系统为特定Cas9蛋白与sgRNA形成的复合体，能精确定位靶向DNA序列并产生切割，使所述靶序列发生双链断裂损伤；所述基因编辑为在细胞中或体外进行基因编辑。所述各Cas9蛋白均具有数量相对少的氨基酸，可与相同的sgRNA形成复合体进行基因编辑。进一步地，所述Sa‑SchCas9蛋白和SchCas9蛋白识别的PAM序列非常简单，所述Sha2Cas9‑HF1蛋白、Sha2Cas9‑HF2蛋白、SpeCas9‑HF1蛋白、SpeCas9‑HF2蛋白和SpeCas9‑HF3蛋白特异性非常高且编辑效率很高。本发明在基因编辑领域中具有广泛的应用前景。
发明专利
CN202410453635.0
2021-07-05
CN118325867A
2024-07-11
C12N9/22(2006.01)
复旦大学
王永明;王帅;高思琪;王瑶
200433 上海市杨浦区邯郸路220号
北京汇知杰知识产权代理有限公司
杨巍%潘璐
上海;31
1.一种Cas9蛋白，所述Cas9蛋白为氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示的Sha2Cas9-HF1蛋白；氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示的Sha2Cas9-HF2蛋白；或氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示的Sha2Cas9-R247A蛋白。 2.一种缀合物，所述缀合物包含： a)Cas9蛋白，所述Cas9蛋白为氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的Sha2Cas9蛋白；氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示的Sha2Cas9-HF1蛋白；氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示的Sha2Cas9-HF2蛋白；或氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示的Sha2Cas9-R247A蛋白； b)可检测标记、或者可检测标记与另外的蛋白和多肽的组合，其中所述另外的蛋白或多肽选自表位标签、报告蛋白或核定位信号(NLS)序列、胞嘧啶脱氨酶(CBE)、腺嘌呤脱氨酶(ABE)、胞嘧啶甲基化酶DNMT3A和MQ1、胞嘧啶去甲基化酶Tet1、转录激活蛋白VP64、p65和RTA、转录抑制蛋白KRAB、组蛋白乙酰化酶p300、组蛋白去乙酰化酶LSD1、和内切酶FokI中的一种或者多种；以及 c)任选的用于连接所述Cas9蛋白与所述可检测标记的接头，例如所述接头为长度为1-50个氨基酸的接头。 3.一种融合蛋白，所述融合蛋白包含： a)Cas9蛋白，所述Cas9蛋白为氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的Sha2Cas9蛋白；氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示的Sha2Cas9-HF1蛋白；氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示的Sha2Cas9-HF2蛋白；或氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示的Sha2Cas9-R247A蛋白； b)另外的蛋白和多肽；以及 c)任选的用于连接所述Cas9蛋白与所述另外的蛋白和多肽的接头，优选地，所述接头为长度为1-50个氨基酸的接头； 其中，所述另外的蛋白或多肽选自表位标签、报告蛋白或核定位信号(NLS)序列、胞嘧啶脱氨酶(CBE)、腺嘌呤脱氨酶(ABE)、胞嘧啶甲基化酶DNMT3A和MQ1、胞嘧啶去甲基化酶Tet1、转录激活蛋白VP64、p65和RTA、转录抑制蛋白KRAB、组蛋白乙酰化酶p300、组蛋白去乙酰化酶LSD1、和内切酶FokI中的一种或者多种。 4.一种分离的核酸分子，所述分离的核酸分子包含编码以下的核酸序列： a)Cas9蛋白，所述Cas9蛋白为氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的Sha2Cas9蛋白；氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示的Sha2Cas9-HF1蛋白；氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示的Sha2Cas9-HF2蛋白；或氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示的Sha2Cas9-R247A蛋白； b)权利要求2所述的缀合物；或者 c)权利要求3所述的融合蛋白。 5.根据权利要求4所述的分离的核酸分子，其中所述分离的核酸分子还包含编码单链向导RNA的核酸序列，所述单链向导RNA包括支架序列，所述支架序列为： 1)SEQ ID NO:47所示的核酸序列；或 2)基于SEQ ID NO:47所述的核酸序列改造得到的且保留其生物学活性的核酸序列，其中所述改造为碱基磷酸化、碱基硫化、碱基甲基化、碱基羟基化中的一种或者多种； 例如所述单链向导RNA在所述支架序列的5’端进一步包括CRISPR间隔序列，所述CRISPR间隔序列为长度为20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个核苷酸(优选21个核苷酸)且能够与靶序列互补配对的序列。 6.一种载体，所述载体包含编码以下的核酸序列： a)Cas9蛋白，所述Cas9蛋白为氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的Sha2Cas9蛋白；氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示的Sha2Cas9-HF1蛋白；氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示的Sha2Cas9-HF2蛋白；或氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示的Sha2Cas9-R247A蛋白； b)权利要求2所述的缀合物；或者 c)权利要求3所述的融合蛋白； 例如所述载体包含SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:32所示的核酸序列或其简并序列； 又例如所述载体为质粒载体、附着体载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体或腺相关病毒载体，例如为pAAV2_ITR载体或pUC19载体。 7.根据权利要求6所述的载体，其中，所述载体进一步包含编码单链向导RNA的核酸序列，所述单链向导RNA包括支架序列，所述支架序列为： 1)SEQ ID NO:47所示的核酸序列；或 2)基于SEQ ID NO:47所述的核酸序列改造得到的且保留其生物学活性的核酸序列，其中所述改造为碱基磷酸化、碱基硫化、碱基甲基化、碱基羟基化中的一种或者多种； 例如，所述载体包含SEQ ID NO:48所示的核酸序列或其简并序列； 又例如，所述载体还包含编码CRISPR间隔序列的核酸序列；例如所述CRISPR间隔序列为长度为20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个核苷酸(优选21个核苷酸)且能够与靶序列互补配对的序列。 8.一种CRISPR/Cas9基因编辑系统，其包含： a)蛋白组分，其包含Cas9蛋白、权利要求2所述的缀合物、或权利要求3所述的融合蛋白； 其中，所述Cas9蛋白为氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的Sha2Cas9蛋白；氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示的Sha2Cas9-HF1蛋白；氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示的Sha2Cas9-HF2蛋白；或氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示的Sha2Cas9-R247A蛋白； b)核酸组分，其包含单链向导RNA，所述单链向导RNA包括支架序列，所述支架序列为： 1)SEQ ID NO:47所示的核酸序列；或 2)基于SEQ ID NO:47所述的核酸序列改造得到的且保留其生物学活性的核酸序列，其中所述改造为碱基磷酸化、碱基硫化、碱基甲基化、碱基羟基化中的一种或者多种； 并且，所述蛋白组分和所述核酸组分相互结合形成复合物； 例如所述单链向导RNA在所述支架序列的5’端进一步包括CRISPR间隔序列，所述CRISPR间隔序列为长度为20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个核苷酸(优选21个核苷酸)且能够与靶序列互补配对的序列。 9.一种细胞，所述细胞包含：权利要求4或5所述的分离的核酸分子、或者权利要求6或7所述的载体；其中，所述细胞为非植物细胞；例如所述细胞为原核细胞或者真核细胞如动物细胞，所述动物细胞为例如哺乳动物细胞如人类细胞。 10.一种对细胞内或体外环境中的靶序列进行基因编辑的方法，所述方法包括：使以下(1)至(4)中任一项与细胞内或体外环境中的靶序列相接触： (1)Cas9蛋白、权利要求2所述的缀合物或权利要求3所述的融合蛋白，和单链向导RNA， 其中，所述Cas9蛋白为氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的Sha2Cas9蛋白；氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示的Sha2Cas9-HF1蛋白；氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示的Sha2Cas9-HF2蛋白；或氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示的Sha2Cas9-R247A蛋白； (2)根据权利要求6所述的载体和包含编码单链向导RNA的核酸序列的载体； (3)根据权利要求7所述的载体；以及 (4)根据权利要求8所述的CRISPR/Cas9基因编辑系统； 其中，所述单链向导RNA包括支架序列，所述支架序列为： a)SEQ ID NO:47所示的核酸序列；或 b)基于SEQ ID NO:47所述的核酸序列改造得到的且保留其生物学活性的核酸序列，其中所述改造为碱基磷酸化、碱基硫化、碱基甲基化、碱基羟基化中的一种或者多种； 其中，在与靶序列接触后，所述Cas9蛋白、缀合物或融合蛋白识别各自的原间隔邻近序列(PAM)，所述PAM位于靶序列的5’端，并且具有序列5’-NNGR； 其中，所述细胞为非植物细胞，例如为原核细胞或者真核细胞如动物细胞，所述动物细胞为例如哺乳动物细胞如人类细胞； 例如，所述基因编辑包括对靶序列的基因敲除、定点碱基的改变、定点插入、基因转录水平的调控、DNA甲基化调控、DNA乙酰化修饰、组蛋白乙酰化修饰、单碱基转换以及染色质成像追踪中的一种或者多种，例如，所述单碱基转换包括碱基腺嘌呤到鸟嘌呤的转换、胞嘧啶到胸腺嘧啶的转换或胞嘧啶到尿嘧啶的转换。 11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述单链向导RNA的CRISPR间隔序列与所述靶序列形成完全碱基互补配对结构，而与非靶序列形成不完全碱基互补配对的结构；例如，所述不完全碱基互补配对结构包括一个或者多个例如两个或者更多个碱基错配的结构。 12.一种试剂盒，所述试剂盒用于对细胞内或者体外环境中的靶序列进行基因编辑，包括： a)选自以下1)至6)中的任一项： 1)Cas9蛋白、根据权利要求2所述的缀合物、或者根据权利要求3所述的融合蛋白，和单链向导RNA；其中，所述Cas9蛋白为氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的Sha2Cas9蛋白；氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示的Sha2Cas9-HF1蛋白；氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示的Sha2Cas9-HF2蛋白；或氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示的Sha2Cas9-R247A蛋白； 2)根据权利要求4所述的分离的核酸分子和包含编码单链向导RNA的核酸序列的分离的核酸分子； 3)根据权利要求5所述的分离的核酸分子； 4)根据权利要求6所述的载体和包含编码单链向导RNA的核酸序列的载体； 5)根据权利要求7所述的载体；或者 6)根据权利要求8所述的CRISPR/Cas9基因编辑系统； 以及 b)如何对细胞内或体外环境中的靶序列进行基因编辑的使用说明； 其中，所述单链向导RNA包括支架序列，所述支架序列为： 1)SEQ ID NO:47所示的核酸序列；或 2)基于SEQ ID NO:47所述的核酸序列改造得到的且保留其生物学活性的核酸序列；所述改造为碱基磷酸化、碱基硫化、碱基甲基化、碱基羟基化中的一种或者多种。