HSD17B13变体及其应用
本文提供与HSD17B13变体相关的组合物，该组合物包含与HSD17B13的变体相关的分离的核酸和蛋白质，本文还提供包含所述核酸和蛋白质的细胞。本文进一步提供与HSD17B13变体相关的方法。这些方法包括通过使用核酸酶试剂，外源供体序列，转录活化剂，转录抑制剂和表达重组HSD17B13基因或编码HSD17B13蛋白质的核酸的表达载体的任何组合修饰细胞的方法。本文还提供用于治疗患有慢性肝病或有发展为慢性肝病的风险的受治者的治疗性方法和预防性方法。
发明专利
CN202410406162.9
2018-01-18
CN118325899A
2024-07-11
C12N15/113(2010.01)
瑞泽恩制药公司
诺拉·S·阿布-胡森;奥姆里·戈特斯曼;亚历山大·李;程希平;辛玉蓉;埃万盖洛斯·普凡尼斯;苏珊娜·哈特福德;杰斯珀·格罗马达;弗雷德里克·E·杜威;阿里斯·巴拉斯;艾伦·舒尔迪纳
美国纽约州塔里敦
广州三环专利商标代理有限公司
郝传鑫
美国;US
1.一种组合物，其用于修饰细胞中HSD17B13基因的方法，所述组合物包含Cas9蛋白或编码所述Cas9蛋白的核酸、和向导RNA或编码所述向导RNA的DNA， 其中所述细胞包括已引入所述组合物的细胞， 其中所述向导RNA包括CRISPR RNA(crRNA)部分和反式激活CRISPR RNA(tracrRNA)部分，并靶向所述HSD17B13基因内的向导RNA靶向序列， 其中所述向导RNA与所述Cas9蛋白形成复合物，并靶向所述向导RNA靶向序列，以及 其中所述Cas9蛋白裂解所述向导RNA靶向序列以在所述HSD17B13基因中产生靶向基因修饰， 其中所述方法导致所述HSD17B13基因的功能丧失，以及 其中所述细胞是肝细胞。 2.根据权利要求1所述的组合物，其中： (a)所述向导RNA靶向序列包括SEQ ID NO：20-239和259-268中的任意一个；和/或 (b)所述向导RNA包括DNA靶向片段，所述DNA靶向片段包括SEQ ID NO：1423-1652中的任意一个；和/或 (c)所述向导RNA包括SEQ ID NO：500-1419中的任意一个。 3.根据权利要求2所述的组合物，其中所述细胞是人细胞，并且其中： (a)所述向导RNA靶向序列包括SEQ ID NO：20-239中的任意一个；和/或 (b)所述DNA靶向片段包括SEQ ID NO：1423-1642中的任意一个；和/或 (c)所述向导RNA包括SEQ ID NO：500-719、730-949、960-1179、和1190-1409中的任意一个。 4.根据权利要求2所述的组合物，其中所述细胞是小鼠细胞，并且其中： (a)所述向导RNA靶向序列包括SEQ ID NO：259-268中的任意一个；和/或 (b)所述DNA靶向片段包括SEQ ID NO：1643-1652中的任意一个；和/或 (c)所述向导RNA包括SEQ ID NO：720-729、950-959、1180-1189、和1410-1419中的任意一个。 5.根据权利要求1-4中任一项所述的组合物，其中所述组合物进一步包含一个或多个额外的向导RNA、或一个或多个编码所述一个或多个额外的向导RNA的DNA，其中所述一个或多个额外的向导RNA靶向所述HSD17B13基因内的一个或多个额外的向导RNA靶向序列，并且 其中所述一个或多个额外的向导RNA与所述Cas9蛋白形成一个或多个复合物，并靶向所述一个或多个额外的向导RNA靶向序列。 6.根据权利要求1-5中任一项所述的组合物，其中所述靶向基因修饰是通过非同源末端结合修复已裂解的向导RNA靶向序列产生的。 7.根据权利要求1-6中任一项所述的组合物，其中所述组合物进一步包含外源供体序列， 其中所述外源供体序列与所述HSD17B13基因中的靶标基因组基因座重组以产生所述靶向基因修饰。 8.根据权利要求7所述的组合物，其中所述外源供体序列通过非同源末端结合介导的插入对所述HSD17B13基因进行修复。 9.根据权利要求7所述的组合物，其中所述外源供体序列通过同源定向修复对所述HSD17B13基因进行修复。 10.根据权利要求9所述的组合物，其中所述外源供体序列包括与所述HSD17B13基因内的5'靶向序列杂交的5'同源臂和与所述HSD17B13基因内的3'靶向序列杂交的3'同源臂，其中所述外源供体序列与所述HSD17B13基因重组。 11.根据权利要求10所述的组合物，其中所述外源供体序列进一步包括位于所述5’同源臂和3’同源臂的侧面的核酸插入体。 12.根据权利要求11所述的组合物，其中所述核酸插入体包括胸腺嘧啶，并且，其中在所述外源供体序列与所述HSD17B13基因重组之后，所述胸腺嘧啶插入在当所述HSD17B13基因与SEQ ID NO:1比对时对应于SEQ IDNO:1的位置12665和12666的核苷酸之间。 13.根据权利要求7-12中任一项所述的组合物，其中所述外源供体序列的长度为约50个核苷酸至约1kb。 14.根据权利要求13所述的组合物，其中所述外源供体序列的长度为约80个核苷酸至约200个核苷酸。 15.根据权利要求7-14中任一项所述的组合物，所述外源供体序列是单链寡脱氧核苷酸。 16.根据权利要求1-15中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含所述编码所述Cas9蛋白的核酸。 17.根据权利要求16所述的组合物，其中所述编码所述Cas9蛋白的核酸包括DNA。 18.根据权利要求16所述的组合物，其中所述编码所述Cas9蛋白的核酸包括RNA。 19.根据权利要求1-18中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含RNA形式的向导RNA。 20.根据权利要求1-18中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含所述编码所述向导RNA的DNA。 21.根据权利要求1-20中任一项所述的组合物，其中所述Cas9蛋白或所述编码Cas9蛋白的核酸和/或所述向导RNA或所述编码向导RNA的DNA位于脂质纳米颗粒中。 22.根据权利要求1-20中任一项所述的组合物，其中所述编码Cas9蛋白的核酸和/或所述编码向导RNA的DNA位于腺相关病毒载体中。 23.根据权利要求1-22中任一项所述的组合物，其中所述向导RNA是单分子向导RNA，其中所述crRNA部分与所述tracrRNA部分相连。 24.根据权利要求23所述的组合物，其中所述向导RNA包括如SEQ IDNO:1420、256、257、或258所示的序列。 25.根据权利要求1-22中任一项所述的组合物，其中所述crRNA部分和所述tracrRNA部分是不同的RNA分子。 26.根据权利要求25所述的组合物，其中所述crRNA部分包括如SEQID NO:1421所示的序列和/或所述tracrRNA部分包括如SEQ ID NO:1422所示的序列。 27.根据权利要求1-26中任一项所述的组合物，其中所述向导RNA包含提供改良稳定性或调节稳定性的修饰。 28.根据权利要求1-27中任一项所述的组合物，其中所述细胞是体内细胞。 29.根据权利要求1-28中任一项所述的组合物，其中所述细胞为人肝细胞或小鼠肝细胞。 30.根据权利要求29所述的组合物，其中所述细胞为人肝细胞。 31.根据权利要求30所述的组合物，其中所述人肝细胞是体内细胞。 32.根据权利要求31所述的组合物，其中所述人肝细胞在患有或易于患上慢性肝病的受治者中。 33.一种组合物，其用于修饰细胞中HSD17B13基因的方法，所述组合物包含Cas9蛋白或编码所述Cas9蛋白的核酸、和向导RNA或编码所述向导RNA的DNA， 其中所述细胞包括已引入所述组合物的细胞， 其中所述向导RNA包括CRISPR RNA(crRNA)部分和反式激活CRISPR RNA(tracrRNA)部分，并靶向所述HSD17B13基因内的向导RNA靶向序列，所述向导RNA靶向序列包括在所述HSD17B13基因与SEQ IDNO:2比对时对应于SEQ ID NO:2的位置12666的位置的1000个核苷酸、或位于在所述HSD17B13基因与SEQ ID NO:2比对时对应于SEQ ID NO:2的位置12666的位置的1000个核苷酸内，以及 其中所述向导RNA与所述Cas9蛋白形成复合物并靶向所述向导RNA靶向序列，且其中所述Cas9蛋白裂解所述向导RNA靶向序列以在所述HSD17B13基因中产生靶向基因修饰。 34.根据权利要求33所述的组合物，其中所述HSD17B13基因没有插入在将所述HSD17B13基因与SEQ ID NO:1比对时对应于SEQ ID NO:1的位置12665和12666的核苷酸之间的胸腺嘧啶。 35.根据权利要求33或34所述的组合物，其中： (a)所述向导RNA靶向序列包括SEQ ID NO：226-239和264-268中的任意一个；和/或 (b)所述向导RNA包括DNA靶向片段，所述DNA靶向片段包括SEQ ID NO：1629-1642和1648-1652中的任意一个；和/或 (c)所述向导RNA包括SEQ ID NO：706-719、936-949、1166-1179、1396-1409、725-729、955-959、1185-1189、和1415-1419中的任意一个。 36.根据权利要求33-35中任一项所述的组合物，其中所述向导RNA靶向序列位于在将所述HSD17B13基因与SEQ ID NO:2比对时对应于SEQ IDNO:2的外显子6和/或内含子6的区域内，或位于在将所述HSD17B13基因与SEQ ID NO:2比对时对应于SEQ ID NO:2的内含子6和/或外显子7的区域内。 37.根据权利要求33-36中任一项所述的组合物，其中所述向导RNA靶向序列位于在将所述HSD17B13基因与SEQ ID NO:2比对时对应于SEQ IDNO:2的位置12666的位置的约50个核苷酸内。 38.根据权利要求33-37中任一项所述的组合物，其中所述向导RNA靶向序列包括在将所述HSD17B13基因与SEQ ID NO:2比对时对应于SEQ IDNO:2的位置12666的位置。 39.根据权利要求33-38中任一项所述的组合物，其中所述的组合物进一步包含一个或多个额外的向导RNA或编码所述一个或多个额外的向导RNA的一个或多个DNA，其中所述一个或多个额外的向导RNA靶向所述的HSD17B13基因内的一个或多个额外的向导RNA靶向序列，以及 其中所述一个或多个额外的向导RNA与所述Cas9蛋白形成一个或多个复合物，并靶向所述一个或多个额外的向导RNA靶向序列，以及 其中所述Cas9蛋白裂解所述一个或多个额外的向导RNA靶向序列。 40.根据权利要求33-39中任一项所述的组合物，其中所述方法导致所述HSD17B13基因的内含子6中的供体剪接位点被中断。 41.根据权利要求33-40中任一项所述的组合物，其中所述方法导致所述HSD17B13基因的功能丧失。 42.根据权利要求33-41中任一项所述的组合物，其中所述靶向基因修饰是通过非同源末端结合修复已裂解的向导RNA靶向序列产生的。 43.根据权利要求33-42中任一项所述的组合物，其中所述组合物进一步包含外源供体序列，并且 其中所述外源供体序列与所述HSD17B13基因中的靶标基因组基因座重组以产生所述靶向基因修饰。 44.根据权利要求43所述的组合物，其中所述外源供体序列通过非同源末端结合介导的插入对所述HSD17B13基因进行修复。 45.根据权利要求43所述的组合物，其中所述外源供体序列通过同源定向修复对所述HSD17B13基因进行修复。 46.根据权利要求45所述的组合物，其中所述外源供体序列包含5’同源臂和3’同源臂，所述5’同源臂与对应于SEQ ID NO:2的位置12666的位置的靶向序列5’杂交，所述3’同源臂与对应于SEQ ID NO:2的位置12666的位置的靶向序列3’杂交，其中所述外源供体序列与所述HSD17B13基因重组。 47.根据权利要求46所述的组合物，其中所述外源供体序列还包含位于所述5’同源臂和3’同源臂的侧面的核酸插入体。 48.根据权利要求47所述的组合物，其中所述核酸插入体包含胸腺嘧啶，并且，其中在所述外源供体序列与所述HSD17B13基因重组之后，所述胸腺嘧啶插入在当所述HSD17B13基因与SEQ ID NO:1比对时对应于SEQ IDNO:1的位置12665和12666的核苷酸之间。 49.根据权利要求43-48中任一项所述的组合物，其中所述外源供体序列的长度为约50个核苷酸至约1kb。 50.根据权利要求49所述的组合物，其中所述外源供体序列的长度为约80个核苷酸至约200个核苷酸。 51.根据权利要求43-50中任一项所述的组合物，其中所述外源供体序列是单链寡脱氧核苷酸。 52.根据权利要求33-51中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含所述编码Cas9蛋白的核酸。 53.根据权利要求52所述的组合物，其中所述编码所述Cas9蛋白的核酸包括DNA。 54.根据权利要求52所述的组合物，其中所述编码所述Cas9蛋白的核酸包括RNA。 55.根据权利要求33-54中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含RNA形式的所述向导RNA。 56.根据权利要求33-54中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含所述编码所述向导RNA的DNA。 57.根据权利要求33-56中任一项所述的组合物，其中所述Cas9蛋白或所述编码所述Cas9蛋白的核酸和/或所述向导RNA或所述编码所述向导RNA的DNA是脂质纳米颗粒。 58.根据权利要求33-56中任一项所述的组合物，其中所述编码所述Cas9蛋白的核酸和/或所述编码所述向导RNA的DNA位于腺相关病毒载体中。 59.根据权利要求33-58中任一项所述的组合物，其中所述向导RNA是单分子向导RNA，其中所述crRNA部分与所述tracrRNA部分相连。 60.根据权利要求59所述的组合物，其中所述向导RNA包括如SEQ IDNO:1420、256、257、或258所示的序列。 61.根据权利要求33-58中任一项所述的组合物，其中所述crRNA部分和所述tracrRNA部分是不同的RNA分子。 62.根据权利要求61所述的组合物，其中所述crRNA部分包括如SEQID NO:1421所示的序列和/或所述tracrRNA部分包括如SEQ ID NO:1422所示的序列。 63.根据权利要求33-62中任一项所述的组合物，其中所述向导RNA包含提供改良稳定性或调节稳定性的修饰。 64.根据权利要求33-63中任一项所述的组合物，其中所述细胞是离体细胞或体内细胞。 65.根据权利要求33-64中任一项所述的组合物，其中的细胞是小鼠细胞、大鼠细胞或人细胞。 66.根据权利要求33-65中任一项所述的组合物，其中所述细胞是人肝细胞、小鼠肝细胞、小鼠多能细胞、或大鼠多能细胞。 67.根据权利要求66所述的组合物，其中所述细胞是人肝细胞。 68.根据权利要求67所述的组合物，其中所述细胞是体内细胞。 69.根据权利要求33-68中任一项所述的组合物，其中所述细胞是人细胞，并且其中： (a)所述向导RNA靶向序列包括SEQ ID NO：226-239中的任意一个；和/或 (b)所述DNA靶向片段包括SEQ ID NO：1629-1642中的任意一个；和/或 (c)所述向导RNA包括SEQ ID NO：706-719、936-949、1166-1179、和1396-1409中的任意一个。 70.根据权利要求33-66中任一项所述的组合物，其中所述细胞是小鼠细胞，并且其中： (a)所述向导RNA靶向序列包括SEQ ID NO：264-268中的任意一个；和/或 (b)所述DNA靶向片段包括SEQ ID NO：1648-1652中的任意一个；和/或 (c)所述向导RNA包括SEQ ID NO：725-729、955-959、1185-1189、和1415-1419中的任意一个。