PEX14基因在调控抗牛肠道病毒感染中的应用及其基因敲除牛肾细胞
本发明公开了过氧化物酶体生物发生因子14(PEX14)基因在调控抗牛肠道病毒(Bovine enterovirus，BEV)感染中的应用以及一种PEX14基因敲除牛肾细胞。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，构建了靶向MDBK细胞PEX14基因的打靶载体，经载体转染与细胞筛选，建立了PEX14基因敲除的抗病毒感染细胞模型。病毒学检测结果表明，PEX14基因敲除细胞对BEV感染表现出显著抗性，BEV在基因敲除细胞上的增殖速度显著低于野生型细胞。以上结果表明在细胞水平上，PEX14基因敲除有效地抑制了该病毒的感染与增殖，该策略可应用于PEX14基因修饰的抗BEV牛的制备。
发明专利
CN202410388007.9
2024-03-31
CN118325970A
2024-07-11
C12N15/867(2006.01)
华中农业大学
郭爱珍;耿元晨;胡长敏;夏青;杨浩;姜传文;陈建国;陈颖钰;陈曦
430070 湖北省武汉市洪山区狮子山街1号
武汉智嘉联合知识产权代理事务所(普通合伙)
徐绍新
湖北;42
1.氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的PEX14蛋白，或编码所述蛋白的基因在调控机体抗病毒感染中的应用，所述病毒为牛肠道病毒(Bovine enterovirus，BEV)。 2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：敲除或沉默PEX14基因，能提高机体的抗病毒感染能力并抑制病毒增殖，而回补PEX14基因则导致机体的抗病毒作用消失。 3.用于敲除或沉默权利要求1中所述PEX14基因的试剂在制备抗病毒感染药物中的用途。 4.一种抗病毒感染的药物，该药物含有用于敲除或沉默权利要求1中所述PEX14基因的试剂。 5.如权利要求4所述的抗病毒感染药物，其特征在于：所述试剂包括，Cas9基因编辑蛋白或其表达载体、以及引导所述Cas9基因编辑蛋白特异性结合PEX14基因的gRNA或其表达载体。 6.一种牛肾细胞，该牛肾细胞因权利要求1中所述的PEX14基因被敲除或沉默而导致具有抗病毒感染能力。 7.如权利要求6所述的牛肾细胞，其特征在于：该牛肾细胞为PEX14-KO，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C202451。 8.一种构建权利要求6所述牛肾细胞的方法，其特征在于包括以下步骤： (1)设计针对PEX14基因的sgRNA序列及其引物，构建sgRNA表达质粒； (2)慢病毒载体包装sgRNA表达质粒； (3)用包装sgRNA表达质粒的慢病毒载体感染含Cas9蛋白的牛肾细胞，获得PEX14基因敲除的多克隆牛肾细胞系； (4)从多克隆牛肾细胞系中克隆挑选单克隆细胞。 9.如权利要求8所述的构建方法，其特征在于：所述sgRNA序列如SEQ ID NO.2所示。 10.如权利要求9所述的构建方法，其特征在于：所述引物序列如SEQ ID NO.3、4所示。