B亚型禽偏肺病毒反向遗传操作系统及其应用
本发明公开了B亚型禽偏肺病毒(Avian metapneumovirus,aMPV)反向遗传操作系统及其应用。所述的反向遗传操作系统包括B亚型禽偏肺病毒全长cDNA感染性克隆质粒以及辅助质粒，所述的B亚型禽偏肺病毒全长cDNA感染性克隆质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还公开了该系统在研究B亚型禽偏肺病毒致病机制以及制备以B亚型禽偏肺病毒为载体的疫苗中的应用。通过该反向遗传操作系统本发明制备得到了一种表达vvIBDV VP2蛋白的重组B亚型aMPV弱毒疫苗株，并对该疫苗株的免疫保护效果进行评价，结果发现该疫苗株可对vvIBDV和aMPV两种病毒提供100%的免疫保护。本发明为B亚型禽偏肺病毒致病机制的研究以及作为疫苗载体提供了技术手段，对家禽业健康发展具有重要意义。
发明专利
CN202410109544.5
2024-01-26
CN117625688A
2024-03-01
C12N15/85(2006.01)
中国农业科学院哈尔滨兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心)
高玉龙;王素艳;陈运通;祁小乐
150069 黑龙江省哈尔滨市南岗区马端街427号
北京科龙寰宇知识产权代理有限责任公司
马鑫
黑龙江;23
1.一种B亚型禽偏肺病毒(Avian metapneumovirus, aMPV)全长cDNA感染性克隆质粒，其特征在于，所述的B亚型禽偏肺病毒全长cDNA感染性克隆质粒的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。 2.权利要求1所述的B亚型禽偏肺病毒全长cDNA感染性克隆质粒在以下方面的应用： （1）通过病毒拯救获得重组B亚型禽偏肺病毒中的应用； （2）作为病毒载体的应用。 3.一种B亚型禽偏肺病毒反向遗传操作系统，其特征在于，所述的反向遗传操作系统包括B亚型禽偏肺病毒全长cDNA感染性克隆质粒以及辅助质粒，所述的B亚型禽偏肺病毒全长cDNA感染性克隆质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。 4.如权利要求3所述的B亚型禽偏肺病毒反向遗传操作系统，其特征在于，所述的辅助质粒包括pCAGGS-N、pCAGGS-P、pCAGGS-M21以及pCAGGS-L。 5.如权利要求4所述的B亚型禽偏肺病毒反向遗传操作系统，其特征在于，辅助质粒pCAGGS-N，pCAGGS-P，pCAGGS-M21，pCAGGS-L通过以下方法制备得到： 以提取得到的aMPV LN16-A株病毒的RNA进行反转录，以获得的cDNA为模板，使用引物对LN16-A株的N、P、M2-1及L基因的ORF进行PCR扩增，将扩增得到的PCR片段与pCAGGS载体采用EcoR I和Xho I双酶切后进行连接，挑取单克隆菌落并进行测序验证，将测序正确的四个辅助质粒分别命名为pCAGGS-N、pCAGGS-P、pCAGGS-M21、pCAGGS-L，引物序列如下： PCAG-N-F： GTCTCATCATTTTGGCAAAGATGTCTCTTGAAAGTATTAGACTCA； PCAG-N-R： AGGGAAAAAGATCTGCTAGCTTACTCAAACTTCTGTGATTTGTCT； PCAG-P-F： GTCTCATCATTTTGGCAAAGATGTCTTTCCCCGAAGGCAAGGA； PCAG-P-R： AGGGAAAAAGATCTGCTAGCCTACATATCAAAGCTGTATATATCA； PCAG-M21-F： GTCTCATCATTTTGGCAAAGATGTCCAGAAGGAATCCCTGCAGA； PCAG-M21-R： AGGGAAAAAGATCTGCTAGCTTAATTACTGCTGTCACCCTTTTGC； PCAG-L-F： GTCTCATCATTTTGGCAAAGATACCTAAAGGATGACTACACTGC； PCAG-L-R： GTCTCATCATTTTGGCAAAGCTATTTTGTGCTCAGTATGTACCC。 6.权利要求3-5任一项所述的B亚型禽偏肺病毒反向遗传操作系统在研究B亚型禽偏肺病毒致病机制以及制备以B亚型禽偏肺病毒为载体的疫苗中的应用。 7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的疫苗为表达鸡传染性法氏囊病病毒超强毒（very virulent IBDV, vvIBDV）VP2蛋白的重组B亚型禽偏肺病毒弱毒疫苗。 8.一种表达鸡传染性法氏囊病病毒超强毒VP2蛋白的重组B亚型禽偏肺病毒弱毒疫苗株，其特征在于，所述的疫苗株是通过将包含vvIBDV VP2基因的B亚型禽偏肺病毒全长cDNA感染性克隆质粒进行病毒拯救后获得的；所述的包含vvIBDV VP2基因的B亚型禽偏肺病毒全长cDNA感染性克隆质粒是将vvIBDV-HLJ0504株VP2基因的转录表达盒插入权利要求1所述的B亚型禽偏肺病毒全长cDNA感染性克隆质粒的G和L基因之间得到的。 9.如权利要求8所述的表达鸡传染性法氏囊病病毒超强毒VP2蛋白的重组B亚型禽偏肺病毒弱毒疫苗株，其特征在于，所述的vvIBDV-HLJ0504株VP2基因的转录表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，插入位点位于SEQ ID NO.1所示序列的9015-9016 bp之间。 10.权利要求8所述的一种表达鸡传染性法氏囊病病毒超强毒VP2蛋白的重组B亚型禽偏肺病毒弱毒疫苗株在制备同时预防鸡传染性法氏囊病病毒超强毒以及B亚型禽偏肺病毒感染的疫苗中的应用。