PRKDC基因敲除免疫缺陷动物模型的构建方法和应用
本发明属于动物模型构建领域，具体涉及PRKDC基因敲除的动物模型的构建方法和应用，在本课题之前的研究中发现采用传统的靶向第一、二等靠前的外显子虽然可以获得PRKDC基因敲除动物，但是无法获得免疫缺陷表型。本发明针对PRKDC基因激酶功能区第#78和#80三个外显子设计两条sgRNAs，大片段的敲除来获得具有免疫缺陷表型的PRKDC基因敲除兔。将sgRNA序列与U6启动子相连，经体外转录等步骤制备显微注射使用的Cas9mRNA和gRNA，将两张RNA混和后，注射到原核期兔受精卵经胚胎移植获得仔兔，通过PCR扩增及Sanger测序鉴定PRKDC基因敲除的家兔模型，本发明构建PRKDC基因敲除的动物模型具有免疫缺陷表型，在模拟人类免疫缺陷疾病以及在肿瘤、人源化研究上具有重要的应用价值。
发明专利
CN202410079320.4
2024-01-18
CN118360331A
2024-07-18
C12N15/85(2006.01)
东北农业大学
宋军;赵祥杰;陶源;尹智;刘忠华
150030 黑龙江省哈尔滨市香坊区长江路600号
哈尔滨市阳光惠远知识产权代理有限公司
刘景祥
黑龙江;23
1.一种构建PRKDC基因敲除免疫缺陷家兔的方法，其特征在于：所述方法包括敲除家兔的PRKDC基因的步骤。 2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述敲除采用CRISPR/Cas9技术对家兔的PRKDC基因进行双sgRNA靶位点设计。 3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述双sgRNA靶位点分别针对家兔的PRKDC基因内含子和/或外显子。 4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述内含子为分别为PRKDC基因的第77号内含子和第80号内含子。 5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：针对PRKDC基因的第70号内含子的sgRNA序列为SEQ ID NO.1，针对PRKDC基因的第80号内含子的sgRNA序列为SEQ ID NO.2。 6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述外显子分别为PRKDC基因的第78号外显子和第80号外显子。 7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：针对PRKDC基因的第78号外显子的sgRNA序列选自SEQ ID NO.3-5之一，针对PRKDC基因的第80号外显子的sgRNA序列选自SEQ IDNO.6-8之一。 8.由权利要求1-7任一项所述方法构建得到的免疫缺陷家兔在免疫系统人源化研究中的应用。 9.一种基于CRISPR-Cas9基因敲除技术的PRKDC基因敲除试剂盒，其特征在于，所述PRKDC基因敲除试剂盒包括SEQ ID NO.1-8任一所示的sgRNA。 10.根据权利要求10所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PRKDC-gRNA体外转录载体，所述PRKDC-gRNA体外转录载体以pU6-gRNA载体为出发载体，含针对PRKDC基因的gRNA；所述gRNA由SEQ ID NO.9到SEQ ID NO.24所示的引物退火得到。