LAMP-CRISPR/Cas12a可视化鉴别RHDV 1型和2型的试剂盒及方法
本发明提供了LAMP‑CRISPR/Cas12a可视化鉴别RHDV 1型和2型的试剂盒及方法，属于病原微生物检测技术领域。本发明建立了针对RHDV1和RHDV2的LAMP‑CRISPR/Cas12a快速检测试剂盒和方法，该平台表现出较高的灵敏度，能够检测到10拷贝/μL的核酸样本，具有良好的特异性，能够特异性鉴别RHDV1和RHDV2型毒株，且与兔其他常见病原体无交叉反应。进一步利用侧流层析试纸条和可视化荧光，在1.5h内得到肉眼可见的结果。本发明所述试剂盒为便携式平台，具有快速、高灵敏、高特异、可视化和低设备要求的优势，可供偏远农村和资源受限地区的临床使用。
发明专利
CN202410078117.5
2024-01-19
CN117587168A
2024-02-23
C12Q1/70(2006.01)
江苏省农业科学院
宋艳华;王芳;伍孟婷;陈萌萌;仇汝龙;范志宇;胡波;魏后军;葛雷;李一鸣
210014 江苏省南京市玄武区钟灵街50号
北京高沃律师事务所
翟羽晨
江苏;32
1.基于LAMP-CRISPR/Cas12a可视化鉴别RHDV 1型和2型的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括LAMP扩增体系和CRISPR/Cas12a检测体系； 所述LAMP扩增体系中包括外引物对F3和B3，内引物对FIP和BIP；针对RHDV1的LAMP扩增体系中外引物对F3和B3的核苷酸序列如SEQ ID No.13-14所示，内引物对FIP和BIP的核苷酸序列如SEQ ID No.15-16所示；针对RHDV2的LAMP扩增体系中外引物对F3和B3的核苷酸序列如SEQ ID No.24-25所示，内引物对FIP和BIP的核苷酸序列如SEQ ID No.26-27所示； 所述CRISPR/Cas12a检测体系中包括gRNA；针对RHDV1的CRISPR/Cas12a检测体系中gRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.37所示；针对RHDV2的CRISPR/Cas12a检测体系中gRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.39所示。 2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述LAMP扩增体系中还包括环引物LF和/或LB；针对RHDV1的LAMP扩增体系中环引物LB的核苷酸序列如SEQ ID No.17所示；针对RHDV2的LAMP扩增体系中环引物LF和LB的核苷酸序列如SEQ ID No.28-29所示。 3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述LAMP扩增体系中还包括LAMP/RT-LAMP2X预混液、待检核酸和无酶水。 4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述CRISPR/Cas12a检测体系还包括LAMP扩增产物、RNA酶抑制剂、NEBuffer 2.1、Cas12a蛋白、ssDNA报告分子和无酶水。 5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括侧流层析试纸条。 6.如权利要求1~5任意一项所述的试剂盒在制备鉴别RHDV1和RHDV2产品中的应用。 7.基于LAMP-CRISPR/Cas12a可视化鉴别RHDV 1型和2型的非疾病诊断目的的方法，其特征在于，包括如下步骤： （1）提取待检测样本的RNA； （2）以步骤（1）提取的RNA为模板，在LAMP扩增体系中进行LAMP扩增； （3）将步骤（2）得到的LAMP扩增产物在CRISPR/Cas12a检测体系中酶切并进行荧光检测； 或将步骤（2）得到的LAMP扩增产物在CRISPR/Cas12a检测体系中酶切并进行侧流层析试纸条检测。 8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述LAMP扩增体系总体积为25μL，12.5μLLAMP/RT-LAMP 2X预混液、2.5μL引物混合物、2μL提取的RNA和8μL无酶水； 针对RHDV1的LAMP扩增体系中，外引物对F3和B3的终浓度分别为200nM，内引物对FIP和BIP的终浓度分别为1200nM，环引物LB的终浓度为600nM；针对RHDV2的LAMP扩增体系中，外引物对F3和B3的终浓度分别为200nM，内引物对FIP和BIP的终浓度分别为800nM，环引物LF和LB的终浓度分别为600nM。 9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，当进行荧光检测时，所述CRISPR/Cas12a检测体系总体积为20μL，2μL LAMP扩增产物、1μL终浓度0.5U/μL的RNA酶抑制剂、2μL终浓度500nM的gRNA、2μL NEBuffer 2.1、1μL终浓度125nM的Cas12a蛋白、1μL终浓度250nM的荧光猝灭ssDNA报告分子和11μL无酶水。 10.如权利要求7所述的方法，其特征在于，当进行侧流层析试纸条检测时，所述CRISPR/Cas12a检测体系总体积为25μL，2μL LAMP扩增产物、1μL终浓度0.5U/μL的RNA酶抑制剂、2μL终浓度500nM的gRNA、2μL NEBuffer 2.1、1μL终浓度125nM的Cas12a蛋白、1μL终浓度100nM的生物素ssDNA报告分子和11μL无酶水。