iPSC来源的COL10A1蛋白低表达MSC细胞株的构建方法及其应用
本发明提供了iPSC来源的COL10A1蛋白低表达MSC细胞株的构建方法及在治疗骨关节炎疾病的细胞药物中的应用，属于分子生物学与细胞技术领域，使用CRISPR系统，向人iPSC细胞中导入含有Cas 9蛋白和靶向COL10A1基因位点的sgRNA的质粒，获得COL10A1基因功能敲除的iPSC细胞株，诱导分化iPSC细胞株，获得COL10A1蛋白低表达的MSC，可应用于治疗骨关节炎疾病的细胞药物。本发明将基因表达调控技术与人iPSC相结合，可以在多能细胞和随后衍生的特化细胞类型中进行精确的疾病建模与工程改造。
发明专利
CN202311783899.4
2023-12-22
CN117448380A
2024-01-26
C12N15/85(2006.01)
上海元戊医学技术有限公司
崔生辉;王先流;靳钧;欧阳平
200120 上海市浦东新区芙蓉花路500弄2号楼1-2层
上海国智知识产权代理事务所(普通合伙)
潘建玲
上海;31
1.iPSC来源的COL10A1蛋白低表达MSC细胞株的构建方法，其特征在于，使用CRISPR系统，向人iPSC细胞中导入含有Cas 9蛋白和靶向COL10A1基因位点的sgRNA的质粒，获得COL10A1基因功能敲除的iPSC细胞株，诱导分化iPSC细胞株，获得COL10A1蛋白低表达的MSC。 2.根据权利要求1所述的iPSC来源的COL10A1蛋白低表达MSC细胞株的构建方法，其特征在于，所述靶向COL10A1基因位点具体为3号外显子中的位点。 3.根据权利要求1所述的iPSC来源的COL10A1蛋白低表达MSC细胞株的构建方法，其特征在于，在设计的sgRNA序列前端添加CACCG序列作为F引物，在sgRNA的反向互补序列前端添加AAAC序列作为R引物。 4.根据权利要求1所述的iPSC来源的COL10A1蛋白低表达MSC细胞株的构建方法，其特征在于，还包含COL10A1基因编辑相关载体构建与切割效率检测： 同时表达Cas 9和sgRNA的质粒选择获取自Addgene的pX330； 通过分子克隆方法将pX330质粒两个BbsⅠ位点即245位点和267位点之间的序列替换为相应的sgRNA序列，获得sgRNA载体； 将上一步骤中构建成功的目标sgRNA载体，利用Lip 3000脂质体转染的方法分别转染至相同细胞量的HEK293T细胞中，在转染48小时后收集细胞，提取基因组DNA； 使用PCR方法扩增目的片段，相应引物序列如SEQ ID NO：7与SEQ ID NO：8所示，回收纯化后，利用T7E1酶切检测的方式，检测靶位点切割后发生NHEJ的效率，根据对琼脂糖电泳后条带的灰度分析，选择切割效率较高的1号sgRNA进行后续实验，相应sgRNA序列如SEQ IDNO：9，相应载体序列如SEQ ID NO：10所示。 5.根据权利要求4所述的iPSC来源的COL10A1蛋白低表达MSC细胞株的构建方法，其特征在于，还包含sgRNA质粒的转导： 人iPSC细胞使用标准方法培养至90％汇合度，消化细胞并计数； 取出1 × 106 - 1 × 107个细胞低速离心，然后取出离心管至生物安全柜中，打开管盖，吸弃上清； 将所述1号sgRNA载体分别吸取0.5 ug - 5 ug，加入电转buffer中； 用移液枪吹打几次混匀后，将全部液体吸出加入细胞沉淀中，重悬细胞后，转移至电转杯中，然后放入电转仪的转染室进行电转操作，电转操作结束后取出电转杯放进生物安全柜，将细胞转移至培养皿。 6.根据权利要求1所述的iPSC来源的COL10A1蛋白低表达MSC细胞株的构建方法，其特征在于，还包含克隆分离与鉴定： 电转后的细胞每天更换培养基，培养两天后，将细胞消化，计数，并接种5000个细胞于10 cm培养皿中； 培养7天，在层流工作台中进行单克隆的挑取，分别接种于24孔板中，继续培养7天，进行阳性克隆的验证； 对获得的iPSC细胞克隆进行PCR检测，用DNA提取试剂盒提取各孔细胞基因组DNA，进行PCR扩增与测序，挑选具有纯合突变序列的细胞克隆。 7.根据权利要求1所述的iPSC来源的COL10A1蛋白低表达MSC细胞株的构建方法，其特征在于，该诱导分化为体外诱导分化，包含如下步骤： iPSC细胞株的培养、经过诱导形成神经嵴细胞系、神经嵴细胞的扩增培养和储存、神经嵴细胞向MSC分化； 使用骨、软骨和脂肪细胞分化培养基诱导分化MSC，证明所得细胞具有向成骨、成软骨和成脂肪细胞分化的能力，具备三系分化能力； 通过WB方法对符合三系分化能力的MSC细胞进行进一步验证，检测目标基因COL10A1的蛋白表达量。 8.根据权利要求1至7任意一项所述iPSC来源的COL10A1蛋白低表达MSC细胞株的构建方法所获得的MSC细胞株在治疗骨关节炎疾病的细胞药物中的应用。