iPSC来源的IL-10蛋白过表达MSC细胞株的构建方法及其应用

摘要：

本发明属于分子生物学与细胞技术领域，提供一种iPSC来源的IL‑10蛋白过表达MSC细胞株的构建方法及其在治疗骨关节炎疾病的细胞药物中的应用。所述构建方法包括使用CRISPR系统，向细胞中导入含有Cas 9蛋白和靶向AAVS1安全位点sgRNA的质粒，以及插入编码IL‑10蛋白序列的供体模板质粒，以获得定点插入IL‑10基因的iPSC细胞株，然后将iPSC细胞株诱导分化，得到可以过表达IL‑10蛋白的MSC。本发明的过表达IL‑10蛋白的MSC可以高效调节关节内免疫环境，相比较天然来源的MSC，有更好的治疗效果。

专利类型：发明专利

申请/专利号：CN202311783871.0

申请日期：2023-12-22

公开/公告号：CN117448379A

公开/公告日：2024-01-26

主分类号：C12N15/85(2006.01)

申请/专利权人:上海元戊医学技术有限公司

发明/设计人:崔生辉;王先流;靳钧;欧阳平

主申请人地址:200120 上海市浦东新区芙蓉花路500弄2号楼1-2层

专利代理机构:上海国智知识产权代理事务所(普通合伙)

代理人:潘建玲

国别省市代码:上海;31

权利要求：

1.iPSC来源的IL-10蛋白过表达MSC细胞株的构建方法，其特征在于，使用CRISPR系统，向细胞中导入含有Cas 9蛋白和靶向基因组安全位点sgRNA的质粒，以及插入编码IL-10蛋白序列的供体模板质粒，以获得定点插入外源IL-10基因的iPSC细胞株，然后诱导分化iPSC细胞株，获得过表达IL-10蛋白的MSC。 2.根据权利要求1所述的iPSC来源的IL-10蛋白过表达MSC细胞株的构建方法，其特征在于，所述基因组安全位点为AAVS1安全位点1号内含子中部的位点。 3.根据权利要求1所述的iPSC来源的IL-10蛋白过表达MSC细胞株的构建方法，其特征在于，在设计的sgRNA序列前端添加CACCG序列作为F引物，在sgRNA的反向互补序列前端添加AAAC序列作为R引物。 4. 根据权利要求1所述的iPSC来源的IL-10蛋白过表达MSC细胞株的构建方法，其特征在于，CRISPR基因编辑载体选择获取自Addgene的pX330，通过常规分子克隆方法将两个BbsⅠ位点即245位点和267位点之间的序列替换为相应的sgRNA序列，获得sgRNA载体，载体序列如SEQ ID NO：9所示。 5.根据权利要求1所述的iPSC来源的IL-10蛋白过表达MSC细胞株的构建方法，其特征在于，所述供体模板质粒主要包括左端同源臂，IL-10蛋白表达序列，右端同源臂。 6. 根据权利要求5所述的iPSC来源的IL-10蛋白过表达MSC细胞株的构建方法，其特征在于，所述IL-10蛋白表达序列主要包括启动子，IL-10蛋白CDS区序列，终止子，所述启动子为CMV启动子序列，所述终止子为bGH Poly(A)信号序列。 7. 根据权利要求1所述的iPSC来源的IL-10蛋白过表达MSC细胞株的构建方法，其特征在于，所述供体模板质粒骨架为获取自Addgene的pUC57载体，合成左端同源臂，1000bp，合成IL-10蛋白插入序列，合成右端同源臂，500bp，通过分子克隆方法将上述三段序列依次插入pUC57载体的EcoR I位点至Hind lll位点之间，获得携带左右同源臂和IL-10同源修复模板的供体模板质粒，模板质粒序列如SEQ ID NO：10所示。 8.根据权利要求1所述的iPSC来源的IL-10蛋白过表达MSC细胞株的构建方法，其特征在于，该诱导分化为体外诱导分化，包含如下步骤：iPSC细胞株的培养、经过诱导形成神经嵴细胞系、神经嵴细胞的扩增培养和储存、神经嵴细胞向MSC分化，即得到可以过表达IL-10蛋白的MSC。 9. 根据权利要求1所述的iPSC来源的IL-10蛋白过表达MSC细胞株的构建方法，其特征在于，对获得的iPSC细胞进行PCR检测，包含如下步骤：提取各孔细胞基因组DNA、进行PCR扩增与测序、挑选具有纯合插入序列的细胞克隆，相应跨同源臂引物序列如SEQ ID NO：11至SEQ ID NO：16所示。 10.根据权利要求1至9任意一项所述iPSC来源的IL-10蛋白过表达MSC细胞株的构建方法所获得的MSC细胞株在治疗骨关节炎疾病的细胞药物中的应用。