MT1X驱动氧化应激下破骨细胞形成作用机制的研究方法
本发明涉及生物技术领域，特别涉及MT1X驱动氧化应激下破骨细胞形成作用机制的研究方法，包括以下步骤：a.检测PMOP骨组织的破骨细胞、PMOP骨组织的破骨细胞前体以及骨髓单核细胞中MT1X的表达水平；b.PMOP的骨髓单核细胞中ROS强度与MT1X表达的检测；c.氧化应激下，RANKL诱导人破骨细胞分化中ROS强度、破骨细胞形成与MT1X表达的检测；d.RANKL诱导下，骨髓单核细胞来源的人OCP中不同氧化应激对MT1X影响；e.不同氧化应激下，RANKL诱导人破骨细胞分化中的相关指标的检测；本发明有望阐明MT1X驱动氧化应激下破骨细胞形成作用及机制，为绝经后骨质疏松症PMOP的发病提供新观点，也为PMOP的防治提供新的理论依据和潜在靶点。
发明专利
CN202311709974.2
2023-12-13
CN117683901A
2024-03-12
C12Q1/6888(2018.01)
柳州市工人医院
韦盛旺
545027 广西壮族自治区柳州市柳南区和平路156号
南宁新途专利代理事务所(普通合伙)
但玉梅
广西;45
1.MT1X驱动氧化应激下破骨细胞形成作用机制的研究方法，其特征在于，包括以下步骤： a.检测PMOP骨组织的破骨细胞、PMOP骨组织的破骨细胞前体以及骨髓单核细胞中MT1X的表达水平； b.PMOP的骨髓单核细胞中ROS强度与MT1X表达的检测； c.氧化应激下，RANKL诱导人破骨细胞分化中ROS强度、破骨细胞形成与MT1X表达的检测； d.RANKL诱导下，骨髓单核细胞来源的人OCP中不同氧化应激对MT1X影响； e.不同氧化应激下，RANKL诱导人破骨细胞分化中的相关指标的检测； 所述研究方法分别从整体、细胞与分子水平出发，系统研究MT1X驱动氧化应激在破骨细胞形成中的作用及机制，包括： (1)鉴定PMOP骨组织中MT1X表达情况，以及MT1X与ROS间的相关性，包括： ①利用免疫荧光双染验证PMOP骨组织的破骨细胞、PMOP骨组织的破骨细胞前体和骨髓单核细胞中MT1X的表达情况；②利用流式细胞鉴定法明确PMOP患者骨髓单核细胞中MT1X阳性细胞数量；③利用荧光染色确定PMOP骨组织中ROS强度和MT1X间的关系；④明确PMOP骨髓单核细胞中ROS强度与MT1X之间的相关性； (2)探究氧化应激对MT1X的影响及MT1X对破骨细胞形成的作用，包括： ①以骨髓单核细胞作为实验目标，利用慢病毒转导过表达或沉默MT1X以及利用免疫荧光染色鉴定氧化应激下，RANKL诱导下的人OCP中MT1X表达与ROS强度间的关系；②利用Westernblotting法和免疫荧光鉴定RANKL诱导下的人OCP中不同氧化应激对于MT1X表达的影响；③利用慢病毒转导和TRAP染色法鉴定氧化应激下，MT1X对于单核细胞向成熟破骨细胞分化的作用； (3)剖析MT1X调控的ROS对RANKL诱导下的破骨细胞形成的具体机制，包括： ①以骨髓单核细胞作为实验目标，利用Westernblotting、免疫荧光、AV/PI染色、罗丹明染色、台盼蓝染色和EdU分析不同氧化应激下，RANKL诱导的人OCP中JNK1活性、Bcl2磷酸化、自噬、凋亡、细胞总死亡、细胞增殖和破骨细胞分化的具体水平，以及与MT1X表达间的关系；②分析不同氧化应激下，RANKL诱导的人OCP中ROS强度与JNK1活性间的关系；③利用免疫共染明确不同氧化应激下，RANKL诱导的人OCP中MT1X与活化JNK1、磷酸化Bcl2间的关系。 2.根据权利要求1所述的MT1X驱动氧化应激下破骨细胞形成作用机制的研究方法，其特征在于，所述步骤a包括以下子步骤： 1)取材：①取发生腰椎骨折的PMOP患者发生骨折部位的骨组织，一部分骨组织固定于酒精，备用于MicroCT扫描，另一部分骨组织固定于4％多聚甲醛，备用于冰冻包埋；②使用同样方法取普通患者相同部位的骨组织，一部分骨组织固定于酒精，备用于MicroCT扫描，另一部分骨组织固定于4％多聚甲醛，备用于冰冻包埋；③分别对发生腰椎骨折的PMOP患者和普通患者予以骨髓穿刺提取骨髓细胞； 2)在取材部位分别予以MicroCT扫描及重建对骨小梁进行结构分析； 3)骨组织标本按常规步骤依次进行固定-脱钙-洗涤-脱水-透明-包埋-切片-贴片，获取冰冻切片，依后续需求进行免疫荧光染色； 4)应用免疫荧光双染色，通过骨基质中破骨细胞、破骨细胞前体的特异性标记RANK与MT1X抗体检测两组骨小梁的破骨细胞、破骨细胞前体中MT1X的表达情况； 组织切片免疫荧光双染色包括以下步骤： ①由冰冻切片仪中取出载有切片的载玻片，放入加湿盒中，铺加PBS于切片上； ②用1％BSA同时混合稀释两种一抗； ③用与泵相连的巴斯德吸管，在切片的一端吸去PBS，并从另一端加上抗体，盖上加湿盒，室温温育1h； ④以PBS冼玻片3次，5min/次； ⑤用1％BSA同时混合稀释两种荧光二抗，切片上加入200μL稀释后的二抗，置加湿盒中室温温育1h，以PBS洗涤3次，5min/次； ⑥将盖玻片放于纸巾上，用10μL含DAPI的封片剂封片，翻过载玻片放于盖玻片上，将玻片置工作台上，用铝箔覆盖避光放置30min； ⑦共聚焦显微镜下观察结果。 5)应用流式细胞鉴定法比较单核细胞中MT1X阳性细胞比例的差异。 3.根据权利要求2所述的MT1X驱动氧化应激下破骨细胞形成作用机制的研究方法，其特征在于，组织切片免疫荧光双染色步骤③中，每一载玻片上加50μL抗体。 4.根据权利要求2所述的MT1X驱动氧化应激下破骨细胞形成作用机制的研究方法，其特征在于，子步骤5)中，应用流式细胞鉴定法比较单核细胞中MT1X阳性细胞比例的差异时分别用CD14和CD11b作为标记抗体。 5.根据权利要求1所述的MT1X驱动氧化应激下破骨细胞形成作用机制的研究方法，其特征在于，所述步骤b包括以下子步骤： 1)在发生腰椎骨折的PMOP患者相同区域的骨组织切片中，分别用针对MT1X的抗体以及DCFH-DA荧光探针进行荧光染色，用于检测ROS强度，明确PMOP骨组织中细胞上MT1X表达与ROS强度之间的关系； 2)对PMOP患者的骨髓予以CD14磁珠抗体富集CD14+骨髓单核细胞，分别予以MT1X抗体以及DCFH-DA荧光探针进行细胞免疫荧光染色，分析单核细胞中ROS强度与MT1X间的相关性； 细胞免疫荧光染色包括以下步骤： ①单核细胞按5×104个/孔的密度接种于12孔板内，用PBS液洗涤3次，5min/次； ②用4％PFA固定液室温固定15min，用PBS液洗涤3次，5min/次； ③加入0.5％Triton 10min增加细胞通透性，用PBS液清洗3次，5min/次； ④载玻片取出，放入加湿盒中，用3％BSA封闭液于37℃封闭30min； ⑤用1％BSA稀释一抗，玻片上加入50μL稀释的一抗，加湿盒中室温温育1h，以PBS清冼玻片3次，5min/次； ⑥用1％BSA稀释荧光二抗，玻片上加入200μL稀释后的二抗，置加湿盒中室温温育1h，以PBS洗涤，再以去离子水洗涤2次，5min/次； ⑦将盖玻片放于纸巾上，用10μL含DAPI的封片剂封片。翻过载玻片放于盖玻片上，勿施压，将玻片置工作台上，用铝箔覆盖避光放置30min； ⑧共聚焦显微镜下观察结果。 6.根据权利要求1所述的MT1X驱动氧化应激下破骨细胞形成作用机制的研究方法，其特征在于，所述步骤c中包括以下子步骤： 1)分别利用带有针对MT1X的shRNA、MT1X-cDNA的慢病毒以及相应对照载体感染PMOP患者的CD14+骨髓单核细胞，用维生素D3将PMOP患者的CD14+骨髓单核细胞诱导为贴壁的人破骨细胞前体，而后用RANKL+M-CSF联合不同浓度的H2O2干预不同时间检测ROS强度，并在干预5天后检测分化的破骨细胞数量； 2)在用上述方案干预了6小时后，用DCFH-DA荧光探针进行荧光染色，检测ROS强度，以分析单核细胞上MT1X表达的改变对ROS强度的影响； 3)在干预了5天后，用TRAP染色法检测成熟的破骨细胞数目，以分析MT1X表达的改变对破骨细胞形成的影响。 7.根据权利要求1所述的MT1X驱动氧化应激下破骨细胞形成作用机制的研究方法，其特征在于，所述步骤d包括以下子步骤： 在骨髓单核细胞来源的人OCP上用RANKL+M-CSF联合不同浓度H2O2干预不同时间，通过Western blotting、免疫荧光检测MT1X表达水平，以分析ROS强度对MT1X表达的影响。 8.根据权利要求1所述的MT1X驱动氧化应激下破骨细胞形成作用机制的研究方法，其特征在于，所述步骤e包括以下子步骤： 1)在骨髓单核细胞来源的人OCP上用RANKL+M-CSF联合不同浓度的H2O2干预不同时间，通过Western blotting检测p-JNK1、JNK1、p-Bcl2、Bcl2、LC3、PARP的表达； 2)干预固定的时间，利用免疫荧光检测LC3 puncta，利用罗丹明、AV/PI染色检测凋亡水平，利用台盼蓝染色检测总细胞死亡水平，利用EdU染色试剂盒检测细胞增殖水平； 3)结合步骤c的结果，分析不同ROS强度对RANKL诱导下细胞中的JNK1活性、Bcl2磷酸化、自噬、凋亡、细胞死亡、细胞增殖与分化的分别影响； 4)结合MT1X的检测，分析MT1X表达在上述过程中的意义。