NF2型神经纤维瘤病相关脑膜瘤永生化细胞系及其构建方法与应用
本发明实施例公开了一种NF2型神经纤维瘤病相关脑膜瘤永生化细胞系及其构建方法与应用。该永生化细胞系保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.45738，保藏时间为2023年10月30日。本发明通过慢病毒载体将外源性永生化基因hTERT和HPV‑16E6/E7导入NF2相关脑膜瘤细胞中，成功构建了一株可持续增值传代的永生化NF2相关脑膜瘤细胞系，并证实了该构建方法的有效性。本发明为NF2相关领域研究提供了同质性良好、操作简便的的临床前研究模型。
发明专利
CN202311681717.2
2023-12-08
CN117660356A
2024-03-08
C12N5/10(2006.01)
首都医科大学附属北京天坛医院
刘丕楠;王博;汪颖;严敏君
100071 北京市丰台区南四环西路119号
北京华清迪源知识产权代理有限公司
朱芳
北京;11
1.一种NF2型神经纤维瘤病相关脑膜瘤永生化细胞系，其特征在于，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCCNo.45738，保藏时间为2023年10月30日。 2.一种如权利要求1所述的NF2型神经纤维瘤病相关脑膜瘤永生化细胞系的构建方法，其特征在于，向NF2型神经纤维瘤病相关脑膜瘤原代细胞转染外源性永生化基因hTERT和HPV-16E6/E7，筛选阳性克隆并传代培养以获得NF2型神经纤维瘤病相关脑膜瘤永生化细胞系。 3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述方法包括： 将NF2型神经纤维瘤病相关脑膜瘤原代细胞接种于六孔板中，使用慢病毒载体将外源性永生化基因hTERT和HPV-16E6/E7导入细胞中，在37℃，5％CO2的培养箱中培养12h后更换新鲜培养基继续培养； 连续使用一周1μg/mL的嘌呤霉素筛选感染成功的细胞，观察细胞长满后进行传代，细胞持续增殖传代至超过20代则视为永生化细胞系建立成功。 4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述培养基为：含有10％胎牛血清的DMEM完全培养基。 5.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述NF2型神经纤维瘤病相关脑膜瘤原代细胞的制备方法包括如下步骤： 1)向新鲜NF2相关脑膜瘤标本中加入消化酶，置于37℃，5％CO2的培养箱中消化2-4小时； 2)过滤除去未被消化的碎块，收集细胞滤液，以1000rpm离心5分钟，弃上清； 3)向沉淀加入红细胞裂解液静置2分钟后加入10mL PBS重悬，1000rpm离心5分钟，弃上清； 4)向沉淀加入10mL PBS重悬，1000rpm离心5分钟，弃上清； 5)向沉淀加入含有10％胎牛血清的DMEM完全培养基重悬，转移至培养皿中，在37℃，5％CO2的培养箱中培养； 6)每隔48-72小时换液，对细胞进行显微镜下观察，挑选脑膜瘤细胞克隆进行扩大培养，得到NF2型神经纤维瘤病相关脑膜瘤原代细胞。 6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述消化酶包括木瓜蛋白酶、胰蛋白酶或胶原酶。 7.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述过滤采用粒径为70μm或40μm的细胞滤网。 8.如权利要求1所述的NF2型神经纤维瘤病相关脑膜瘤永生化细胞系的用途，其特征在于，所述用途选自如下任一项： a.制备NF2型神经纤维瘤病相关脑膜瘤细胞或动物模型； b.制备用于治疗NF2型神经纤维瘤病相关脑膜瘤的药物； c.筛选NF2型神经纤维瘤病相关脑膜瘤的治疗靶点。