GAA基因拷贝数变异检测用的引物和探针及其试剂盒
本申请公开了一种GAA基因拷贝数变异检测用的引物和探针及其试剂盒，探针包括覆盖GAA基因的20个外显子的36个探针组、覆盖至少一个参照基因的至少一个所述探针组；每一所述探针组包括分别与目标位点的5’端和3’端至少部分互补的5’端探针和3’端探针；引物包括针对探针组的正向引物和反向引物。本申请能够覆盖GAA基因的全部20个外显子，每个外显子上均覆盖有1个或2个探针组，能够一次性对每个外显子的大片段缺失或重复进行检测，检测通量高，检测效率高，连接产物采用通用引物进行扩增，扩增效率基本一致，引入了多个参照基因位点进行数据校正计算，准确性高。
发明专利
CN202311636902.X
2023-12-01
CN117512099A
2024-02-06
C12Q1/6883(2018.01)
苏州天昊医学检验实验室有限公司%天昊生物医药科技(苏州)有限公司
余锋;姜正文;张德康
215000 江苏省苏州市工业园区星湖街218号生物纳米园B7楼501单元;
苏州三英知识产权代理有限公司
黄晨
江苏;32
1.一种GAA基因拷贝数变异检测用的引物和探针，其特征在于， 所述探针包括： 覆盖位于GAA基因的20个外显子上共36个目标位点的36个探针组，所述20个外显子上共36个目标位点的位置如说明书表1中NO.1至NO.36所示； 覆盖位于参照基因上至少一个目标位点的至少一个所述探针组； 其中，每一所述探针组包括分别与目标位点的5’端和3’端至少部分互补的5’端探针和3’端探针； 所述引物包括针对所述探针组的正向引物和反向引物。 2.根据权利要求1所述的引物和探针，其特征在于，每一所述5’端探针包括依次排列的第一通用引物结合位点和第一连接序列，每一所述3’端探针包括依次排列的第二连接序列和第二通用引物结合位点，其中，所述第一连接序列和所述第二连接序列分别与目标位点的5’端和3’端至少部分互补； 所述引物包括： 针对所述第一通用引物结合位点的第一通用引物组，包括至少一个第一通用引物，每一所述第一通用引物至少与一个所述5’端探针的所述第一通用引物结合位点至少部分互补； 针对所述第二通用引物结合位点的第二通用引物组，包括至少一个第二通用引物，每一所述第二通用引物至少与一个所述3’端探针的所述第二通用引物结合位点至少部分互补。 3.根据权利要求2所述的引物和探针，其特征在于，针对所述20个外显子的36个探针组的第一连接序列如SEQ ID NO.1～36所示，第二连接序列如SEQ ID NO.37～72所示。 4.根据权利要求2所述的引物和探针，其特征在于，所述探针还包括： 覆盖位于GAA基因上游的6个目标位点的6个所述探针组，所述GAA基因上游的6个目标位点的位置如说明书表1中NO.37至NO.42所示，针对GAA基因上游的6个探针组的第一连接序列如SEQ ID NO.73～78所示，第二连接序列如SEQ ID NO.79～84所示； 覆盖位于GAA基因3’端非翻译区的4个目标位点的4个所述探针组，所述GAA基因3’端非翻译区的4个目标位点的位置如说明书表1中NO.43至NO.46所示，针对GAA基因3’端非翻译区的4个探针组的第一连接序列如SEQ ID NO.85～88所示，第二连接序列如SEQ ID NO.89～92所示； 覆盖位于GAA基因下游的2个目标位点的2个所述探针组，所述GAA基因下游的2个目标位点的位置如说明书表1中NO.47至NO.48所示，针对GAA基因下游的2个探针组的第一连接序列如SEQ ID NO.93～94所示，第二连接序列如SEQ ID NO.95～96所示； 覆盖位于X染色体的1个目标位点的1个所述探针组，所述X染色体的1个目标位点的位置如说明书表1中NO.49所示，针对X染色体的1个探针组的第一连接序列如SEQ ID NO.97所示，第二连接序列如SEQ ID NO.98所示； 覆盖位于Y染色体的1个目标位点的1个所述探针组，所述Y染色体的1个目标位点的位置如说明书表1中NO.50所示，针对Y染色体的1个探针组的第一连接序列如SEQ ID NO.99所示，第二连接序列如SEQ ID NO.100所示。 5.根据权利要求2所述的引物和探针，其特征在于，所述探针包括覆盖位于参照基因上的32个目标位点的32个探针组，所述参照基因的32个目标位点的位置如说明书表1中NO.51至NO.82所示，针对参照基因的32个探针组的第一连接序列如SEQ ID NO.101～132所示，第二连接序列如SEQ ID NO.133～164所示。 6.根据权利要求2至5任一所述的引物和探针，其特征在于，所述第一通用引物组包括用不同荧光基团标记的多个第一通用引物，所述第二通用引物组包括连接有不同长度的填充序列的多个第二通用引物。 7.根据权利要求6所述的引物和探针，其特征在于，所述第一通用引物组包括四个第一通用引物，序列如SEQ ID NO.165～168所示，所述四个第一通用引物的5’端分别被不同荧光基团标记；所述第二通用引物组包括两个第二通用引物，序列如SEQ ID NO.169～170所示； 每一所述探针组的5’端探针的第一通用引物结合位点选自SEQ ID NO.171～174所示序列中的一个，每一所述探针组的3’端探针的第二通用引物结合位点选自SEQ ID NO.175～176所示序列中的一个。 8.一种GAA基因拷贝数变异检测用的试剂盒，其特征在于，包括： 第一连接预混合液，包括4×GC Solution和探针混合液，所述探针混合液包括权利要求1至7任一所述的探针； 第二连接预混合液，包括10×Taq缓冲液和Taq连接酶； 连接反应终止液，包括EDTA； PCR预混合液，包括10×PCR缓冲液、dNTP、MgCl2、引物混合液和Taq DNA聚合酶，所述引物混合液包括权利要求1至7任一所述的引物。 9.一种如权利要求8所述的试剂盒的使用方法，其特征在于，包括： 将所述第一连接预混合液和样本DNA混合，之后加入所述第二连接预混合液进行连接反应，以使所述探针连接至目标位点； 加入所述连接反应终止液； 加入PCR预混合液，进行PCR扩增； 将扩增后的PCR产物变性后进行毛细管电泳，将扩增片段分离，得到每个所述扩增片段的信息并进行拷贝数计算。 10.根据权利要求9所述的使用方法，其特征在于，所述探针包括若干探针group，每一所述探针group包括多个探针组，所述多个探针组包括至少一个针对GAA基因的检测探针组以及至少一个针对参照基因的参照探针组，且每一所述探针group的所述多个探针组对应于相同的正向引物和反向引物； 所述得到每个所述扩增片段的信息并进行拷贝数计算的步骤包括： 将所述探针group内的一检测探针组a对应的扩增片段的荧光峰高值除以同一探针group内的一参照探针组b对应的扩增片段的荧光峰高值，得到所述检测探针组a的R值； 将检测样本中所述检测探针组a的R值分别除以n个正常参照样本中所述检测探针组a的R值再乘以正常参照样本中所述检测探针组a的拷贝数，得到所述检测探针组a针对所述参照探针组b的n个校正拷贝数值，其中，所述检测样本为待检测GAA基因拷贝数的样本，所述正常参照样本为已知GAA基因拷贝数正常的样本； 当n大于1时，计算所述n个校正拷贝数值的平均值、标准方差及变异系数，若所述n个校正拷贝数值的变异系数小于10％，取所述n个校正拷贝数值的平均值作为所述检测探针组a针对所述参照探针组b的相对拷贝数； 若所述n个校正拷贝数值的变异系数大于10％，则依次剔除离所述n个校正拷贝数值的中位数最远的校正拷贝数值，直至剩余的m个校正拷贝数值的变异系数小于5％，其中，m大于或等于2n/3，取所述m个校正拷贝数值的平均值作为所述检测探针组a针对所述参照探针组b的相对拷贝数； 若不存在剩余的m个校正拷贝数值的变异系数小于5％，则取所述n个校正拷贝数值的中位数作为所述检测探针组a针对所述参照探针组b的相对拷贝数； 重复上述步骤，分别计算所述检测探针组a针对同一探针group内所有参照探针组的相对拷贝数，得到所述检测探针组a的i个相对拷贝数； 计算所述i个相对拷贝数的平均值、标准方差及变异系数，若所述i个相对拷贝数的变异系数小于10％，取所述i个相对拷贝数的平均值作为所述检测探针组a对应的扩增片段的拷贝数； 若所述i个相对拷贝数的变异系数大于10％，则依次剔除离所述i个相对拷贝数的中位数最远的相对拷贝数，直至剩余的j个相对拷贝数的变异系数小于5％，其中，j大于或等于2n/3，取所述j个相对拷贝数的平均值作为所述检测探针组a对应的扩增片段的拷贝数； 若不存在剩余的j个相对拷贝数的变异系数小于5％，则取所述i个相对拷贝数的中位数作为所述检测探针组a对应的扩增片段的拷贝数。