D-氨基酸氧化酶突变体、核酸分子、重组菌株及其应用
本发明涉及生物化工技术领域，特别涉及D‑氨基酸氧化酶突变体、核酸分子、重组菌株及其应用。本发明提供了D‑氨基酸氧化酶的突变体、核酸分子、重组菌株及其应用。本发明通过筛选获得了增强对催化底物DL‑草铵膦催化活力的突变型D‑氨基酸氧化酶，并通过添加融合标签或肽标签的方法，使得宿主表达获得的D‑氨基酸氧化酶的活性和可溶性表达进一步提高。利用本发明提供的D‑氨基酸氧化酶制备α‑酮酸的方法实现了外消旋草铵膦的动力学拆分，能够广泛应用到L‑草铵膦的生产应用中。
发明专利
CN202311581696.7
2023-11-24
CN117604004A
2024-02-27
C12N15/53(2006.01)
浙江新安化工集团股份有限公司%浙江大学杭州国际科创中心
周曙光;杨立荣;秦龙;徐佳琪;余神銮;周海胜;康欣;王子渊;楼亿圆;张泽伟
311600 浙江省杭州市建德市江滨中路新安大厦1号;
北京集佳知识产权代理有限公司
王晓芬
浙江;33
1.如下任意项在提高D-氨基酸氧化酶可溶性表达中的应用： (I)、包含编码野生型的D-氨基酸氧化酶的核酸分子和标签的基因元件；和/或 (II)、编码具有L25P、A79R、T168R、M228P、A254E和G359R中任意一个或多个位点突变的D-氨基酸氧化酶的核酸分子；和/或 (III)、包含编码具有L25P、A79R、T168R、M228P、A254E和G359R中任意一个或多个位点突变的D-氨基酸氧化酶的核酸分子和标签的基因元件； 所述标签选自MBP、NUSA、Fh8、T7B9、6K和NT11中的至少一种。 2.D-氨基酸氧化酶的突变体，其特征在于，其包括L25P、A79R、T168R、M228P、A254E和G359R中任意一个或多个突变位点。 3.编码如权利要求2所述突变体的核酸分子。 4.如权利要求3所述的核酸分子，其特征在于，其具有： (I)、如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；或 (II)、与(I)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(I)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或 (III)、与(I)或(II)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(I)或(II)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或 (IV)、与(I)、(II)或(III)所述核苷酸序列具有至少90％序列同源性的核苷酸序列。 5.表达单元，其特征在于，其含有启动子、如权利要求3或4所述的核酸分子和终止子。 6.如权利要求5所述的表达单元，其特征在于，所述启动子包括T7启动子；所述终止子包括T7终止子。 7.质粒载体，其特征在于，包括如下任意项和骨架载体： (I)、如权利要求3或4所述的核酸分子；和/或 (II)、如权利要求5或6所述的表达单元。 8.如权利要求7所述的质粒载体，其特征在于，还包括标签； 所述标签选自MBP、NUSA、Fh8、T7B9、6K和NT11中的至少一种； 所述骨架载体包括pET载体。 9.质粒组合，其特征在于，包括如下任意项，和含有编码标签的核酸分子的质粒载体； (I)、如权利要求7或8所述的质粒载体；和/或 (II)、含有编码野生型的D-氨基酸氧化酶的核酸分子的质粒载体； 所述标签选自MBP、NUSA、Fh8、T7B9、6K和NT11中的至少一种。 10.宿主，其特征在于，包括如下任意项： (I)、如权利要求3或4所述的核酸分子；和/或 (II)、如权利要求5或6所述的表达单元；和/或 (III)、如权利要求7或8所述的质粒载体；和/或 (IV)、如权利要求9所述的质粒组合。 11.如权利要求10所述的宿主，其特征在于，所述宿主包括大肠杆菌； 所述大肠杆菌包括BL21(DE3)。 12.如下任意项在制备D-氨基酸氧化酶中的应用： (I)、如权利要求3或4所述的核酸分子；和/或 (II)、如权利要求5或6所述的表达单元；和/或 (III)、如权利要求7或8所述的质粒载体；和/或 (IV)、如权利要求9所述的质粒组合；和/或 (V)、如权利要求10或11所述的宿主。 13.D-氨基酸氧化酶的制备方法，其特征在于，包括发酵培养如权利要求10或11所述的宿主细胞，获得D-氨基酸氧化酶。 14.如权利要求13所述的制备方法制得的D-氨基酸氧化酶。 15.以下任意项在制备α-酮酸中的应用： (I)、如权利要求2所述的突变体；和/或 (II)、如权利要求3或4所述的核酸分子；和/或 (III)、如权利要求5或6所述的表达单元；和/或 (IV)、如权利要求7或8所述的质粒载体；和/或 (V)、如权利要求9所述的质粒组合；和/或 (VI)、如权利要求10或11所述的宿主。 16.α-酮酸的制备方法，其特征在于，包括以D-氨基酸或外消旋氨基酸为底物，利用如权利要求14所述的D-氨基酸氧化酶进行氧化反应，获得α-酮酸； 所述底物的浓度包括0.2mol/L；所述氧化反应的温度包括30℃，时间包括6h。 17.以下任意项在制备L-草铵膦中的应用： (I)、如权利要求2所述的突变体；和/或 (II)、如权利要求3或4所述的核酸分子；和/或 (III)、如权利要求5或6所述的表达单元；和/或 (IV)、如权利要求7或8所述的质粒载体；和/或 (V)、如权利要求9所述的质粒组合；和/或 (VI)、如权利要求10或11所述的宿主。 18.L-草铵膦的制备方法，其特征在于，包括以D-氨基酸或外消旋氨基酸为底物，加入如权利要求14所述的D-氨基酸氧化酶、谷氨酸脱氢酶、乙醇脱氢酶、过氧化氢酶、NAD+混合，搅拌，制得L-草铵膦； 所述底物的浓度包括0.2mol/L；所述搅拌时的温度包括40℃；所述搅拌时的pH包括8.0。