Mdh2基因条件性敲除小鼠模型的构建方法和应用

摘要：

本申请涉及生物技术领域，具体涉及一种Mdh2基因条件性敲除小鼠模型的构建方法和应用，该方法包括构建Mdh2基因条件性敲除小鼠模型的方法，其特征在于，对小鼠Mdh2基因的2号外显子进行flox修饰，获得flox实验鼠；将所述flox实验鼠与Cre工具鼠配繁，将所得后代相互配繁，获得Mdh2基因条件性敲除小鼠模型。本申请的构建方法简单高效，特异性强，该方法制得的Mdh2基因条件性敲除小鼠模型可用于筛选治疗雌性不育的药物。

专利类型：发明专利

申请/专利号：CN202311573291.9

申请日期：2023-11-23

公开/公告号：CN117568403A

公开/公告日：2024-02-20

主分类号：C12N15/85(2006.01)

申请/专利权人:中信湘雅生殖与遗传专科医院有限公司

发明/设计人:张珏;郑伟;戴菁;林戈

主申请人地址:410000 湖南省长沙市高新开发区桐梓坡西路567号

专利代理机构:华进联合专利商标代理有限公司

代理人:董洪荣

国别省市代码:湖南;43

权利要求：

1.构建Mdh2基因条件性敲除小鼠模型的方法，其特征在于，对小鼠Mdh2基因的2号外显子进行flox修饰，获得flox实验鼠； 将所述flox实验鼠与Cre工具鼠配繁，将所得后代相互配繁，获得Mdh2基因条件性敲除小鼠模型。 2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述Cre工具鼠的Cre酶在激活卵泡的卵母细胞中特异性表达。 3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，利用CRISPR/Cas9技术结合Loxp/Cre的方法对小鼠Mdh2基因的2号外显子进行flox修饰。 4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述CRISPR/Cas9技术所用到的sgRNA引物包括sgRNA1和sgRNA2； 所述sgRNA1包含如SEQ ID No.1所示的序列； 所述sgRNA2包含如SEQ ID No.2所示的序列。 5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，对小鼠Mdh2基因的2号外显子进行flox修饰，获得flox实验鼠，其包括如下步骤： 将载有编码Cas9 mRNA、sgRNA的DNA序列的载体，以及靶标载体一同注射入小鼠受精卵后移植代孕，获得F0代小鼠， 将所述F0代小鼠与野生型小鼠杂交，获得F1代小鼠， 将所述F1代小鼠中的flox杂合子小鼠自交，获得F2代小鼠； 筛选所述F2代小鼠中的flox纯合子小鼠，获得所述flox实验鼠。 6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，获得F0代小鼠后，进行基因鉴定，选取所述F0代小鼠中含有flox序列的阳性小鼠与野生型小鼠杂交，获得F1代小鼠。 7.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于，将所述flox实验鼠与Cre工具鼠配繁，将所得后代相互配繁，其包括如下步骤： 将所述flox实验鼠与所述Cre工具鼠杂交，获得F3代小鼠； 选取所述F3代小鼠中Cre阳性的flox杂合子小鼠与所述flox实验鼠回交，获得F4代小鼠； 筛选所述F4代小鼠中的Cre阳性的flox纯合子小鼠，获得所述Mdh2基因敲除小鼠模型。 8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，获得所述Mdh2基因敲除小鼠模型后，对其进行基因鉴定，包括取所述Mdh2基因敲除小鼠模型的DNA进行PCR扩增； 进一步，所述PCR扩增所使用的引物包含如SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示序列的引物。 9.权利要求1～8任一项所述的方法制得的Mdh2基因条件性敲除小鼠模型在筛选治疗Mdh2基因缺陷相关的疾病的药物中的应用。 10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述与Mdh2基因缺陷相关的疾病包括雌性不育。