DNA条形码、引物、试剂盒、方法和应用
本发明提供了DNA条形码、引物、试剂盒、方法和应用。本发明利用蛋白质基因组学技术选择核糖体‑L30标准基因序列作为所述DNA条形码，其能够实现布朗克假丝酵母(Candida blankii)种内菌株的快速鉴别与区分。由此，本发明建立了普洱茶工业发酵生产用布朗克假丝酵母(Candida blankii)TMCC 70011菌种的标准基因序列和样品鉴别方法。相比于传统的形态学鉴定方法，本发明的方法具有通用、易扩增、易比对的特点，显著提高了鉴定效率，从而为普洱茶发酵工业可控纯种发酵工艺保护和微生物菌种资源挖掘、保护和利用提供了有力的技术手段。
发明专利
CN202311563960.4
2023-11-22
CN117604147A
2024-02-27
C12Q1/6895(2018.01)
云南大益微生物技术有限公司%勐海茶业有限责任公司
施佳辉;徐平;唐蜀昆;张亚峰;高慧英;曾新生;邵爱菊;潘淑康;蒋洁琳;陈川龙;贾鳗
650220 云南省昆明市滇中新区大板桥街道云水路1号A17栋301;
北京天昊联合知识产权代理有限公司
王静%高钊
云南;53
1.一种用于鉴别布朗克假丝酵母菌株或由其发酵生产的普洱茶的DNA条形码，其特征在于，该DNA条形码来源于布朗克假丝酵母TMCC 70011菌株的基因组，并且选自如SEQ IDNo.4所示的DNA序列中的至少250bp的序列。 2.根据权利要求1所述的DNA条形码，其中所述DNA条形码的核苷酸序列包含如SEQ IDNo.1或SEQ ID No.2所示的序列；或者，所述DNA条形码选自如SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示的DNA序列中的序列；优选地，所述DNA条形码的核苷酸序列如SEQ ID No.1、SEQ IDNo.2或SEQ ID No.4所示。 3.一种用于扩增权利要求1或2所述的DNA条形码的引物对。 4.根据权利要求3所述的引物对，其正向引物的核苷酸序列与布朗克假丝酵母TMCC70011菌株基因组中的这样的序列相同：该序列为从所述TMCC 70011菌株基因组中如SEQID No.4所示的核苷酸序列的第1位到如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列的第316位的区域中的序列，并且该正向引物的长度为15-30bp；其反向引物与所述TMCC 70011菌株基因组中的这样的序列反向互补：该序列为从所述TMCC 70011菌株基因组中如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列的第236位到如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列的最后一位的区域中的序列，并且该反向引物的长度为15-30bp。 5.根据权利要求4所述的引物对，所述正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如下所示： 正向引物：5’-AGCCAAGGTGCTTTCCAGTA-3’； 反向引物：5’-ATGTGATGGGAACCCTTTTG-3’。 6.一种用于鉴别布朗克假丝酵母TMCC 70011菌株或由其发酵生产的普洱茶的试剂盒，包含根据权利要求3-5中任一项所述的引物对。 7.一种鉴别布朗克假丝酵母TMCC 70011菌株的方法，包括以下步骤： a)提供待测菌株的基因组DNA； b)以步骤a)所述的基因组DNA为模板，利用根据权利要求3-5中任一项所述的引物对进行PCR扩增，得到PCR产物； c)电泳检测PCR产物，如果没有目标条带，则判定待测菌株不是布朗克假丝酵母TMCC70011菌株；如果有目标条带，则进行步骤d)和/或e)； d)对所得PCR产物进行测序，得到待测核苷酸序列；将所述待测核苷酸序列与权利要求1或2所述的DNA条形码的核苷酸序列进行同源性比对，若同源性大于99％，则判定待测菌株为布朗克假丝酵母TMCC 70011菌株； e)对所得PCR产物进行核酸质谱分析，若该PCR产物的碱基质量与权利要求1或2所述的DNA条形码的碱基质量存在差异，并且存在质量差异的碱基数目大于或等于10个，则判定待测菌株不是布朗克假丝酵母TMCC 70011菌株。 8.一种鉴别由布朗克假丝酵母TMCC 70011菌株发酵生产的普洱茶的方法，包括以下步骤： a)提供普洱茶样品； b)从所述普洱茶样品中提取微生物菌株的基因组DNA； c)以步骤b)所述的基因组DNA为模板，利用根据权利要求3-5中任一项所述的引物对进行PCR扩增，得到PCR产物； d)电泳检测PCR产物，如果没有目标条带，则判定所述普洱茶不是由布朗克假丝酵母TMCC 70011菌株发酵生产的普洱茶；如果有目标条带，则进行步骤e)和/或f)； e)对所得PCR产物进行测序，得到待测核苷酸序列；将所述待测核苷酸序列与权利要求1或2所述的DNA条形码的核苷酸序列进行同源性比对，若同源性大于99％，则判定所述普洱茶为由布朗克假丝酵母TMCC 70011菌株发酵产生的普洱茶； f)对所得PCR产物进行核酸质谱分析，若该PCR产物的碱基质量与权利要求1或2所述的DNA条形码的碱基质量存在差异，并且存在质量差异的碱基数目大于或等于10个，则判定所述普洱茶不是由布朗克假丝酵母TMCC 70011菌株发酵产生的普洱茶。 9.根据权利要求1或2所述的DNA条形码在鉴别布朗克假丝酵母TMCC 70011菌株或由其发酵生产的普洱茶中的应用。 10.根据权利要求3-5中任一项所述的引物对在鉴别布朗克假丝酵母TMCC 70011菌株或由其发酵生产的普洱茶中的应用。 11.根据权利要求6所述的试剂盒在鉴别布朗克假丝酵母TMCC 70011菌株或由其发酵生产的普洱茶中的应用。