PCR预混液及PCR扩增方法
本申请涉及PCR预混液及PCR扩增方法，该PCR预混液包括聚乙二醇辛基苯基醚、辛基苯基‑聚乙烯二醇、BSA和蓝色葡聚糖2000。聚乙二醇辛基苯基醚、辛基苯基‑聚乙烯二醇、BSA和蓝色葡聚糖2000组分复配，协同促使未经处理的样本细胞裂解，对释放的RNA和热启动Tth酶同时具有保护作用，显著提高PCR扩增效果。利用该PCR预混液进行扩增时，无需对样本进行核酸提取或裂解、去基因组和逆转录反应等复杂的前处理操作，可以直接在样本加入上述PCR预混液进行扩增反应。
发明专利
CN202311544184.3
2023-11-20
CN117431305A
2024-01-23
C12Q1/686(2018.01)
湖北擎科生物科技有限公司
肖晓文;华丽萍;曹文刚;宋辉
436000 湖北省鄂州市葛店开发区建设大道216号东湖高新智慧城7栋
北京华进京联知识产权代理有限公司
王勤思
湖北;42
1.一种PCR预混液，其特征在于，所述PCR预混液包括聚乙二醇辛基苯基醚、辛基苯基-聚乙烯二醇、BSA和蓝色葡聚糖2000。 2.根据权利要求1所述的PCR预混液，其特征在于，所述PCR预混液包括以下工作浓度的组分： 0.01％v/v～0.1％v/v聚乙二醇辛基苯基醚、0.05％v/v～0.5％v/v辛基苯基-聚乙烯二醇、0.05％w/v～0.5％w/v BSA和0.005％w/v～0.05％w/v蓝色葡聚糖2000。 3.根据权利要求1所述的PCR预混液，其特征在于，所述PCR预混液还包括适配体； 可选地，所述适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。 4.根据权利要求3所述的PCR预混液，其特征在于，所述适配体在所述PCR预混液中的工作浓度为0.05μM～1μM。 5.根据权利要求1～4任一项所述的PCR预混液，其特征在于，所述PCR预混液还包括酶、缓冲基质、dNTPs、阳离子、RNA酶抑制剂、增强剂、去除基因组DNA试剂、还原剂和荧光染料中的一种或多种。 6.根据权利要求5所述的PCR预混液，其特征在于，所述PCR预混液满足以下条件中的一种或多种： (1)所述酶包括DNA聚合酶和/或逆转录酶； 可选地，所述DNA聚合酶包括热启动DNA聚合酶，和/或所述逆转录酶包括M-MLV反转录酶和/或AMV反转录酶； 进一步可选地，所述热启动DNA聚合酶选自热启动Taq酶和/或热启动Tth酶； (2)所述缓冲基质包括磷酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、HEPES缓冲液、硼酸缓冲液、醋酸缓冲液和Tris-HCl缓冲液中的至少一种； (3)所述阳离子包括K+、Mg2+和NH4+中的至少一种； (4)所述增强剂包括甘油； (5)所述去除基因组DNA试剂包括dsDNase； (6)所述还原剂包括TCEP。 7.根据权利要求6所述的PCR预混液，其特征在于，所述PCR预混液包括以下工作浓度的各组分： 0.01％v/v～0.1％v/v聚乙二醇辛基苯基醚、0.05％v/v～0.5％v/v辛基苯基-聚乙烯二醇、0.05％w/v～0.5％w/v BSA、0.005％w/v～0.05％w/v蓝色葡聚糖2000、0.25μM～1μM适配体、1.5U/mL～2.5U/mL热启动Tth酶、1.5U/mL～2.5U/mL dsDnase、10U/μl～15U/μlRNA酶抑制剂、1.5％v/v～3％v/v甘油、40mM～50mM Tris-HCl、15mM～25mM K+、1.5mM～3mMMg2+、10mM～15mM NH4+、0.1mM～0.25mM dNTPs、1.5mM～2.5mM TCEP和0.2×～1×荧光染料。 8.包括权利要求1～7任一项所述PCR预混液的试剂或试剂盒。 9.一种PCR扩增方法，其特征在于，所述PCR扩增方法包括使用权利要求1～7任一项所述PCR预混液或使用权利要求8所述的试剂或试剂盒进行扩增； 可选地，扩增的样本包括细胞样本； 可选地，所述PCR扩增方法包括将细胞样本直接加入所述PCR预混液中进行扩增； 可选地，所述PCR包括RT-qPCR。 10.权利要求1～7任一项所述PCR预混液或权利要求8所述的试剂或试剂盒用于慢病毒滴度测定； 可选地，慢病毒包括HIV-1型慢病毒； 进一步可选地，所述HIV-1型慢病毒滴度测定所使用的引物包括如SEQ ID NO.10～11所示序列的引物。