Oya病毒RNA依赖的RNA聚合酶突变体、其表达载体和载体组合物及应用

摘要：

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种Oya病毒RNA依赖的RNA聚合酶突变体、其表达载体和载体组合物及应用。所述Oya病毒RNA依赖的RNA聚合酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明通过将野生型RNA依赖的RNA聚合酶第756位氨基酸残基从赖氨酸(K)突变为谷氨酸(E)，获得的RNA依赖的RNA聚合酶突变体的酶活性明显降低，有利于降低Oya病毒复制能力和生长速率，进而显著降低Oya病毒毒力，为构建病毒减毒株和开发减毒活疫苗提供了新的思路和途径，对防控Oya病毒感染和传播具有重要意义。

专利类型：发明专利

申请/专利号：CN202311511751.5

申请日期：2023-11-09

公开/公告号：CN117568303A

公开/公告日：2024-02-20

主分类号：C12N9/12(2006.01)

申请/专利权人:中国科学院武汉病毒研究所

发明/设计人:夏菡;王静林;熊国典;王飞;袁志明

主申请人地址:430207 湖北省武汉市江夏区郑店街道黄金工业园金龙大街262号

专利代理机构:武汉同誉知识产权代理有限公司

代理人:万娟

国别省市代码:湖北;42

权利要求：

1.一种Oya病毒RNA依赖的RNA聚合酶突变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。 2.一种突变L基因表达载体，其特征在于，所述表达载体插入有编码RNA依赖的RNA聚合酶突变体的突变L基因，所述RNA依赖的RNA聚合酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。 3.根据权利要求2所述的突变L基因表达载体，其特征在于，所述突变L基因的DNA序列如SEQ ID NO.29所示。 4.根据权利要求2所述的突变L基因表达载体，其特征在于，所述表达载体为pCAGGS载体或pLCK载体。 5.一种载体组合物，其特征在于，所述载体组合物包括如权利要求2-4任一项所述的突变L基因表达载体，还包括M基因表达载体和S基因表达载体，所述M基因表达载体插入有Oya病毒M基因，所述M基因的DNA序列如SEQ ID NO.30所示，所述S基因表达载体插入有Oya病毒S基因，所述S基因的DNA序列如SEQ ID NO.31所示。 6.根据权利要求5所述的载体组合物，其特征在于，所述突变L基因表达载体、所述M基因表达载体和所述S基因表达载体的质量比为1-3：1-2：1。 7.如权利要求1所述的Oya病毒RNA依赖的RNA聚合酶突变体、如权利要求2-4任一项所述的突变L基因表达载体或如权利要求5-6任一项所述的载体组合物在制备Oya病毒减毒株或减毒灭活疫苗中的应用。 8.一种Oya病毒减毒株的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将如权利要求5-6任一项所述的载体组合物按突变L基因表达载体、M基因表达载体和S基因表达载体质量比为1-3：1-2：1共转入宿主细胞中，利用反向遗传操作系统，拯救出致重组Oya病毒减毒株。 9.根据权利要求8所述的Oya病毒减毒株的制备方法，其特征在于，所述突变L基因表达载体的构建方法包括以下步骤：通过如SEQ ID NO.21-22所示的引物对扩增得到线性化pLCK载体，通过如SEQ ID NO.23-24所示的引物对扩增得到L基因，将所述线性化pLCK载体和所述L基因通过同源重组技术连接，得到表达野生型L基因的模板质粒；利用如SEQ IDNO.14和SEQ ID NO.17所示的携带突变位点的引物对扩增所述模板质粒全长，所得扩增产物用限制性内切酶消化，之后通过同源重组技术将所述模板质粒环化，得到所述突变L基因表达载体； 所述M基因表达载体的构建方法包括以下步骤：通过如SEQ ID NO.21-22所示的引物对扩增得到线性化pLCK载体，通过如SEQ ID NO.25-26所示的引物对扩增得到M基因，将所述线性化pLCK载体和所述M基因通过同源重组技术连接，得到所述M基因表达载体； 所述S基因表达载体的构建方法包括以下步骤：通过如SEQ ID NO.21-22所示的引物对扩增得到线性化pLCK载体，通过如SEQ ID NO.27-28所示的引物对扩增得到S基因，将所述线性化pLCK载体和所述S基因通过同源重组技术连接，得到所述S基因表达载体； 所述宿主细胞为BSR-T7细胞。 10.一种重组Oya病毒减毒株，其特征在于，由如权利要求8-9任一项所述的Oya病毒减毒株的制备方法制备得到。