CRISPR-Cas系统及其应用
本文公开了Cas12i多肽及其在CRISPR‑Cas系统中的应用。本文具体公开了Cas12i多肽、Cas12i融合多肽、引导RNA、Cas12i多肽或融合多肽与引导RNA形成的复合物、核酸、载体、载体系统、递送系统、试剂盒、组合物、以及利用上述组分修饰核酸的方法。
发明专利
CN202311464815.0
2023-11-06
CN117431235A
2024-01-23
C12N9/22(2006.01)
微光基因(苏州)有限公司
陈柏洪;胡洋;余宇霖;谭文琼;林少芸;徐文倡;吴幼玉;马肖杰;余嘉俊;孙金帅
215127 江苏省苏州市(江苏)自由贸易试验区苏州桑田街218号生物医药产业园二期23楼101、201单元
广州文冠倪律知识产权代理事务所(普通合伙)
何锦标%张玉颖
江苏;32
1.工程化的嵌合Cas12i多肽，其包含Nuc结构域，其中所述Nuc结构域来源于第一Cas12i多肽的Nuc结构域，所述工程化的嵌合Cas12i多肽的非Nuc结构域部分来源于第二Cas12i多肽的非Nuc结构域部分，所述第一Cas12i多肽与所述第二Cas12i多肽相比序列同一性不超过80％，并且所述工程化的嵌合Cas12i多肽能够结合核酸，并且任选地切割所述核酸。 2.根据权利要求1所述的工程化的嵌合Cas12i多肽，其中所述工程化的嵌合Cas12i多肽： (i)包含与SEQ ID NO.1或2所示的氨基酸序列相比具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；或 (ii)包含与SEQ ID NO.1或2的aa 1至897以及aa 1008至1044的氨基酸序列相比具有至少80％序列同一性且与SEQ ID NO.1或2的aa 898至1007的氨基酸序列相比具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。 3.工程化的嵌合Cas12i多肽，其能够结合核酸，并且任选地切割所述核酸，所述工程化的嵌合Cas12i多肽： (i)包含与SEQ ID NO.3至6任一项所示的氨基酸序列相比具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；或 (ii)包含与SEQ ID NO.3至6任一项的aa 1至895以及aa 1016至1054的氨基酸序列相比具有至少80％序列同一性且与SEQ ID NO.3至6任一项的aa 896至1015的氨基酸序列相比具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。 4.工程化的嵌合Cas12i多肽，其能够结合核酸，并且任选地切割所述核酸，所述工程化的嵌合Cas12i多肽由N端至C端包含依次连接的第一肽段、第二肽段和第三肽段，其中： 所述第一肽段包含与SEQ ID NO.1的aa 1至897或SEQ ID NO.3的aa 1至895的氨基酸序列相比具有至少80％序列同一性的氨基酸序列； 所述第二肽段包含与SEQ ID NO.67至72任一项所示的氨基酸序列相比具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；并且 所述第三肽段包含与SEQ ID NO.1的aa 1008至1044或SEQ ID NO.3的aa 1016至1054的氨基酸序列相比具有至少80％序列同一性氨基酸序列。 5.根据权利要求1至4任一项所述的工程化的嵌合Cas12i多肽，其中所述工程化的嵌合Cas12i多肽被突变以使其具有以下一个或多个特征： (i)核酸切割活性部分或完全失活，或核酸切割活性增强； (ii)核酸结合活性增强。 6.根据权利要求2所述的工程化的嵌合Cas12i多肽，其中所述工程化的嵌合Cas12i多肽，根据SEQ ID NO.1所示的序列编号，在D1009位置处具有氨基酸取代，优选被丙氨酸取代。 7.根据权利要求2所述的工程化的嵌合Cas12i多肽，其中所述工程化的嵌合Cas12i多肽，根据SEQ ID NO.1所示的序列编号，在N229位置处具有氨基酸取代，优选被赖氨酸、精氨酸或组氨酸取代，更优选被精氨酸取代。 8.根据权利要求1或7所述的工程化的嵌合Cas12i多肽，其中所述工程化的嵌合Cas12i多肽， (i)包含与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列相比具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；或 (ii)包含与SEQ ID NO.1的aa 1至897以及aa 1008至1044的氨基酸序列相比具有至少80％序列同一性且与SEQ ID NO.1或2的aa 898至1007的氨基酸序列相比具有至少80％序列同一性的氨基酸序列； 并且，所述工程化的嵌合Cas12i多肽在D924和S925两个位置中的至少一个处具有氨基酸取代，优选被赖氨酸、精氨酸或组氨酸取代，更优选被精氨酸取代。 9.一种CRISPR-Cas系统，其包含： (a)Cas12i多肽，所述Cas12i多肽选自权利要求1至8任一项所述的工程化的嵌合Cas12i多肽；以及 (b)引导RNA，所述引导RNA与所述Cas12i多肽复合以引导所述Cas12i多肽结合至靶核酸。 10.根据权利要求9所述的CRISPR-Cas系统，其中所述引导RNA包含与所述靶核酸杂交的引导区段和与Cas12i多肽结合的重复区段，并且所述引导RNA不包含且不结合tracrRNA。 11.根据权利要求10所述的CRISPR-Cas系统，其中所述引导RNA的重复区段包含SEQ IDNO.7至14任一项所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO.7至14任一项所示的核苷酸序列相比具有1至10个核苷酸替换、缺失和/或插入的核苷酸序列；优选地，其中所述引导RNA的重复区段为SEQ ID NO.7至14任一项所示的核苷酸序列。 12.一种融合多肽，其包含与一个或多个异源多肽融合的Cas12i多肽，所述Cas12i多肽选自权利要求1至8任一项所述的工程化的嵌合Cas12i多肽。 13.根据权利要求12所述的融合多肽，其中所述一个或多个异源多肽独立地为表位标签、核定位信号或具有以下一种或多种酶促活性：逆转录酶活性、核酸酶活性、甲基转移酶活性、脱甲基化酶活性、乙酰转移酶活性、脱乙酰酶活性、激酶活性、磷酸酶活性、泛素连接酶活性、脱泛素化活性、腺苷酸化活性、脱腺苷酸化活性、SUMO化活性、脱SUMO化活性、核糖基化活性、脱核糖基化活性、豆蔻酰化活性、脱豆蔻酰化活性、糖基化活性(例如来自O-GlcNAc转移酶)和脱糖基化活性、DNA修复活性、DNA损伤活性、脱氨酶活性、歧化酶活性、烷基化活性、脱嘌呤活性、氧化活性、嘧啶二聚体形成活性、整合酶活性、转座酶活性、重组酶活性、聚合酶活性、连接酶活性、解旋酶活性、光裂合酶活性和糖基化酶活；更优选地，所述酶促活性结构域具有以下一种或多种酶促活性：脱氨酶活性、甲基转移酶活性、脱甲基酶活性、乙酰转移酶活性和脱乙酰酶活性；优选地，所述一个或多个异源多肽独立地为转录阻遏结构域、转录激活结构域、脱氨酶结构域。 14.根据权利要求13所述的融合多肽，其中所述转录激活结构域包含选自以下的酶形成的结构域：转录激活因子、组蛋白赖氨酸甲基转移酶、组蛋白赖氨酸脱甲基酶、组蛋白乙酰转移酶以及DNA脱甲基酶；优选地，所述转录阻遏结构域包含选自以下的结构域：转录阻遏物、ZIM3结构域、KOX1阻遏结构域、Mad mSIN3相互作用结构域(SID)、ERF阻遏物结构域(ERD)、SRDX阻遏结构域、组蛋白赖氨酸甲基转移酶、组蛋白赖氨酸脱甲基酶、组蛋白赖氨酸脱乙酰酶、DNA甲基化酶以及外周募集元件；更优选地，所述转录激活结构域包含VP64；P65；RTA；截短的P65；截短的RTA；或它们各自或之间的一个或多个的融合形式；更优选地，所述转录阻遏结构域选自KRAB催化结构域、DNA甲基转移酶或其组合。 15.根据权利要求14所述的融合多肽，其中所述融合多肽的结构选自： NH2-[Cas12i]-[转录调控结构域]-COOH； NH2-[转录调控结构域]-[Cas12i]-COOH； NH2-[Cas12i]-[转录激活结构域]-COOH； NH2-[转录激活结构域]-[Cas12i]-COOH； NH2-[NLS]-[Cas12i]-[转录激活结构域]-COOH； NH2-[Cas12i]-[转录激活结构域]-[NLS]-COOH； NH2-[NLS]-[Cas12i]-[转录激活结构域]-[NLS]-COOH； NH2-[NLS]-[转录激活结构域]-[Cas12i]-COOH； NH2-[转录激活结构域]-[Cas12i]-[NLS]-COOH； NH2-[NLS]-[转录激活结构域]-[Cas12i]-[NLS]-COOH； NH2-[Cas12i]-[VP64-P65-RTA融合蛋白及其截短的融合蛋白]-COOH； NH2-[VP64-P65-RTA融合蛋白及其截短的融合蛋白]-[Cas12i]-COOH； NH2-[NLS]-[Cas12i]-[VP64-P65-RTA融合蛋白及其截短的融合蛋白]-COOH； NH2-[Cas12i]-[VP64-P65-RTA融合蛋白及其截短的融合蛋白]-[NLS]-COOH； NH2-[NLS]-[Cas12i]-[VP64-P65-RTA融合蛋白及其截短的融合蛋白]-[NLS]-COOH； NH2-[NLS]-[VP64-P65-RTA融合蛋白及其截短的融合蛋白]-[Cas12i]-COOH； NH2-[VP64-P65-RTA融合蛋白及其截短的融合蛋白]-[Cas12i]-[NLS]-COOH； NH2-[NLS]-[Cas12i]-[VP64-P65-RTA融合蛋白及其截短的融合蛋白]-[NLS]-COOH； NH2-[Cas12i]-[转录抑制结构域]-COOH； NH2-[转录抑制结构域]-[Cas12i]-COOH； NH2-[NLS]-[Cas12i]-[转录抑制结构域]-COOH； NH2-[Cas12i]-[转录抑制结构域]-[NLS]-COOH； NH2-[NLS]-[Cas12i]-[转录抑制结构域]-[NLS]-COOH； NH2-[NLS]-[转录抑制结构域]-[Cas12i]-COOH； NH2-[转录抑制结构域]-[Cas12i]-[NLS]-COOH； NH2-[NLS]-[转录抑制结构域]-[Cas12i]-[NLS]-COOH； NH2-[Cas12i]-[第一转录抑制结构域]-[第二转录抑制结构域]-COOH； NH2-[Cas12i]-[第二转录抑制结构域]-[第一转录抑制结构域]-COOH； NH2-[第一转录抑制结构域]-[第二转录抑制结构域]-[Cas12i]-COOH； NH2-[第二转录抑制结构域]-[第一转录抑制结构域]-[Cas12i]-COOH； NH2-[第一转录抑制结构域]-[Cas12i]-[第二转录抑制结构域]-COOH； NH2-[第二转录抑制结构域]-[Cas12i]-[第一转录抑制结构域]-COOH； NH2-[NLS]-[Cas12i]-[KRAB催化结构域]-[DNMT3A-DNMT3L]-COOH； NH2-[Cas12i]-[KRAB催化结构域]-[DNMT3A-DNMT3L]-[NLS]-COOH； NH2-[NLS]-[Cas12i]-[KRAB催化结构域]-[DNMT3A-DNMT3L]-[NLS]-COOH； NH2-[NLS]-[KRAB催化结构域]-[DNMT3A-DNMT3L]-[Cas12i]-COOH； NH2-[KRAB催化结构域]-[DNMT3A-DNMT3L]-[Cas12i]-[NLS]-COOH； NH2-[NLS]-[KRAB催化结构域]-[DNMT3A-DNMT3L]-[Cas12i]-[NLS]-COOH； NH2-[NLS]-[KRAB催化结构域]-[Cas12i]-[DNMT3A-DNMT3L]-COOH； NH2-[KRAB催化结构域]-[Cas12i]-[DNMT3A-DNMT3L]-[NLS]-COOH； NH2-[NLS]-[KRAB催化结构域]-[Cas12i]-[DNMT3A-DNMT3L]-[NLS]-COOH； NH2-[NLS]-[DNMT3A-DNMT3L]-[Cas12i]-[KRAB催化结构域]-COOH； NH2-[DNMT3A-DNMT3L]-[Cas12i]-[KRAB催化结构域]-[NLS]-COOH；和 NH2-[NLS]-[DNMT3A-DNMT3L]-[Cas12i]-[KRAB催化结构域]-[NLS]-COOH。 16.根据权利要求13所述的融合多肽，其中所述脱氨酶结构域包括腺苷脱氨酶结构域、胞苷脱氨酶结构域或其组合；优选地，所述胞苷脱氨酶选自活化诱导的胞苷脱氨酶(AID)、载脂蛋白B mRNA编辑复合物(APOBEC)和PmCDA1；优选地，所述腺苷脱氨酶结构域是TadA、ecTadA、saTadA、ecTadA7.10、TadA-8e、TadA8.17、TadA8.20、TadA9或其组合。 17.根据权利要求16所述的融合多肽，其中所述融合多肽的结构选自： NH2-[腺苷脱氨酶结构域]-[Cas12i]-COOH； NH2-[Cas12i]-[腺苷脱氨酶结构域]-COOH； NH2-[第一腺苷脱氨酶结构域]-[第二腺苷脱氨酶结构域]-[Cas12i]-COOH； NH2-[第一腺苷脱氨酶结构域]-[Cas12i]-[第二腺苷脱氨酶结构域]-COOH； NH2-[Cas12i]-[第一腺苷脱氨酶结构域]-[第二腺苷脱氨酶结构域]-COOH； NH2-[第二腺苷脱氨酶结构域]-[第一腺苷脱氨酶结构域]-[Cas12i]-COOH； NH2-[第二腺苷脱氨酶结构域]-[Cas12i]-[第一腺苷脱氨酶结构域]-COOH； NH2-[Cas12i]-[第二腺苷脱氨酶结构域]-[第一腺苷脱氨酶结构域]-COOH； NH2-[腺苷脱氨酶结构域]-[Cas12i]-[NLS]-COOH； NH2-[Cas12i]-[腺苷脱氨酶结构域]-[NLS]-COOH； NH2-[NLS]-[腺苷脱氨酶结构域]-[Cas12i]-COOH； NH2-[NLS]-[Cas12i]-[腺苷脱氨酶结构域]-COOH； NH2-[NLS]-[腺苷脱氨酶结构域]-[Cas12i]-[NLS]-COOH； NH2-[NLS]-[Cas12i]-[腺苷脱氨酶结构域]-[NLS]-COOH； NH2-[胞苷脱氨酶结构域]-[Cas12i]-[尿嘧啶糖基化酶抑制剂(UGI)]-COOH； NH2-[尿嘧啶糖基化酶抑制剂(UGI)]-[Cas12i]-[胞苷脱氨酶结构域]-COOH； NH2-[NLS]-[胞苷脱氨酶结构域]-[Cas12i]-[尿嘧啶糖基化酶抑制剂(UGI)]-COOH； NH2-[NLS]-[尿嘧啶糖基化酶抑制剂(UGI)]-[Cas12i]-[胞苷脱氨酶结构域]-COOH； NH2-[胞苷脱氨酶结构域]-[Cas12i]-[尿嘧啶糖基化酶抑制剂(UGI)]-[NLS]-COOH； NH2-[尿嘧啶糖基化酶抑制剂(UGI)]-[Cas12i]-[胞苷脱氨酶结构域]-[NLS]-COOH； NH2-[NLS]-[胞苷脱氨酶结构域]-[Cas12i]-[尿嘧啶糖基化酶抑制剂(UGI)]-[NLS]-COOH；和 NH2-[NLS]-[尿嘧啶糖基化酶抑制剂(UGI)]-[Cas12i]-[胞苷脱氨酶结构域]-[NLS]-COOH。 18.一种复合物，其包含权利要求12至17任一项所述的融合多肽以及引导RNA，所述引导RNA与所述融合多肽复合以引导所述融合多肽结合至靶核酸；优选地，所述引导RNA包含与所述靶核酸杂交的引导区段和与融合多肽结合的重复区段，并且所述引导RNA不包含且不结合tracrRNA；优选地，所述引导RNA的重复区段包含SEQ ID NO.7至14任一项所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO.7至14任一项所示的核苷酸序列相比具有1至10个核苷酸替换、缺失和/或插入的核苷酸序列；优选地，其中所述引导RNA的重复区段为SEQ ID NO.7至14任一项所示的核苷酸序列。 19.根据权利要求18所述的复合物，其中所述复合物是表观遗传编辑器，其包含权利要求14或15所述的融合多肽；优选地，所述融合多肽包含SEQ ID NO.88至93任一个所示的氨基酸序列。 20.根据权利要求18所述的复合物，其中所述复合物是碱基编辑器，其包含权利要求16或17所述的融合多肽；优选地，所述融合多肽包含SEQ ID NO.94至97任一个所示的氨基酸序列。 21.一种核酸，其包含编码如权利要求1至8任一项所述的工程化的嵌合Cas12i多肽或权利要求12至17任一项所述的融合多肽的多核苷酸；优选地，所述多核苷酸被密码子优化以在原核或真核细胞中表达；优选地，所述多核苷酸包含或为如SEQ ID NO.59至64任一个所示的核苷酸序列。 22.一种核酸，其包含引导RNA或编码所述引导RNA的核苷酸序列，所述引导RNA包含重复区段，包含SEQ ID NO.7至14任一项所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO.7至14任一项所示的核苷酸序列相比具有1至10个核苷酸替换、缺失和/或插入的核苷酸序列；优选地，其中所述引导RNA的重复区段为SEQ ID NO.7至14任一项所示的核苷酸序列；优选地，所述引导RNA不包含且不结合tracrRNA；优选地，所述核酸是DNA或mRNA。 23.一种载体，其包含权利要求21和/或22所述的核酸；优选地，所述载体是质粒或病毒载体；优选地，所述病毒载体是腺相关病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体或单纯疱疹病毒载体。 24.一种载体系统，其包括第一载体和与第一载体不同的第二载体，所述第一载体包含权利要求21所述的核酸；所述第二载体包含权利要求22所述的核酸；优选地，所述第一载体和第二载体独立地是质粒或病毒载体；优选地，所述病毒载体是腺相关病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体或单纯疱疹病毒载体。 25.一种递送系统，包含权利要求1至8任一项所述的工程化的嵌合Cas12i多肽、权利要求9至11任一项所述的CRISPR-Cas系统、权利要求12至17任一项所述的融合多肽、权利要求18至20任一项所述的复合物、权利要求21或22所述的核酸、权利要求23所述的载体、或权利要求24所述的载体系统；优选地，所述递送系统包括脂质体、纳米颗粒或外泌体。 26.一种细胞，其包含权利要求1至8任一项所述的工程化的嵌合Cas12i多肽、权利要求9至11任一项所述的CRISPR-Cas系统、权利要求12至17任一项所述的融合多肽、权利要求18至20任一项所述的复合物、权利要求21或22所述的核酸、权利要求23所述的载体、权利要求24所述的载体系统、或权利要求25所述的递送系统；优选地，所述细胞是真核细胞；更优选地，所述细胞是人细胞。 27.一种组合物或试剂盒，其包含权利要求1至8任一项所述的工程化的嵌合Cas12i多肽、权利要求9至11任一项所述的CRISPR-Cas系统、权利要求12至17任一项所述的融合多肽、权利要求18至20任一项所述的复合物、权利要求21或22所述的核酸、权利要求23所述的载体、权利要求24所述的载体系统、权利要求25所述的递送系统或权利要求26所述的细胞；以及药学上可接受的载体。 28.一种修饰靶核酸的方法，所述方法包括使靶核酸与权利要求9至11任一项所述的CRISPR-Cas系统、权利要求18至20任一项所述的复合物、权利要求23所述的载体、权利要求24所述的载体系统、或权利要求25所述的递送系统接触，所述接触导致所述靶核酸被修饰；优选地，所述修饰包括增加或减少所述靶核酸中的靶序列的表达，或所述修饰包括对所述靶核酸中的靶腺嘌呤或靶胞嘧啶进行脱氨基以实现碱基对转换。 29.根据权利要求28所述的方法，其中所述靶核酸选自：双链DNA、单链DNA、RNA、基因组DNA和染色体外DNA；优选地，其中所述接触在体外在细胞外部发生、在培养的细胞内部发生或在体内细胞内部发生；优选地，所述细胞是真核细胞，更优选为人细胞。