Spem2基因点突变小鼠模型的构建方法、试剂盒及其应用

摘要：

本申请属于动物模型技术领域，具体涉及一种Spem2基因点突变小鼠模型的构建方法、试剂盒及其应用。通过设计的sgRNA靶向Spem2基因第三号外显子上的该突变p.R151W（AGA to TGG），能够模拟患者所携带的突变位点，由于Spem2基因在人和小鼠中均为睾丸特异性表达的基因之一，从而构建出了有效的能够模拟患者所携带的Spem2突变位点的小鼠模型。该模型的建立对于深入分析该突变的致病性，研究Spem2基因的具体功能，探讨相关的致病机制，并为临床上该类基因缺陷患者的治疗提供理论基础等方面具有重要意义。

专利类型：发明专利

申请/专利号：CN202311437029.1

申请日期：2023-11-01

公开/公告号：CN117448377A

公开/公告日：2024-01-26

主分类号：C12N15/85(2006.01)

申请/专利权人:中信湘雅生殖与遗传专科医院有限公司%湖南光琇高新生命科技有限公司

发明/设计人:李永;谭跃球;涂超峰;蒙岚岚;何文斌;王韦力;胡童谣;谢春波;卢文庆;林戈;卢光琇

主申请人地址:410000 湖南省长沙市高新开发区桐梓坡西路567号;

专利代理机构:华进联合专利商标代理有限公司

代理人:王秉丽

国别省市代码:湖南;43

权利要求：

1.一种Spem2基因点突变模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤： （1）获取靶向小鼠Spem2基因第三号外显子p.R151W位置的sgRNA与同源修复模板DonorDNA； 所述sgRNA的序列如SEQ ID NO.1所示；所述模板Donor DNA的序列如SEQ ID NO.2所示； （2）采用sgRNA构建sgRNA/Cas9表达载体，体外转录，制备mRNA； （3）将所述mRNA以及所述Donor DNA引入小鼠受精卵，获得F0代小鼠； （4）从所述F0代小鼠中筛选Spem2基因点突变稳定的小鼠遗传系作为阳性F0代小鼠，将阳性F0代小鼠与野生型小鼠杂交得到F1代杂合子小鼠，再将F1代杂合子小鼠交配得到稳定遗传变异的F2代Spem2基因点突变纯合小鼠。 2.根据权利要求1所述的Spem2基因点突变小鼠模型的构建方法，其特征在于，采用PCR法筛选阳性F0代小鼠，PCR法筛选时所使用的检测引物如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。 3.根据权利要求1所述的Spem2基因点突变小鼠模型的构建方法，其特征在于，PCR法筛选时的扩增的程序为：94℃~96℃条件反应4min~6min，1个循环；93℃~95℃条件反应25s~35s，35个循环；56℃~60℃条件反应28s~32s；70℃~74℃条件反应38s~42s；70℃~74℃条件反应8min~12min，1个循环；3.5℃~4.5℃条件反应55min~65min，1个循环。 4.根据权利要求1~3任一项所述的Spem2基因点突变小鼠模型的构建方法，其特征在于，小鼠的品系选自C57BL/6或DBA/2。 5.一种构建Spem2基因点突变小鼠模型的试剂盒，其特征在于，含有sgRNA以及同源修复模板Donor DNA，所述sgRNA的序列如SEQ ID NO.1所示，所述同源修复模板Donor DNA的序列如SEQ ID NO.2所示。 6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，还包括用于筛选阳性F0代小鼠的检测引物对； 可选地，所述检测引物对的序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。 7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括Cas9 mRNA。 8.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括Taq DNA聚合酶、dNTPs和Mg2+中的一种或多种。 9.权利要求1~4任一项所述的构建方法或权利要求5~8任一项所述的试剂盒制得的Spem2基因点突变小鼠模型在药物筛选中的应用。 10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述药物包括治疗精子发生障碍的药物。