Pcc胁迫下魔芋及根际土壤微生物群落变化检测方法
本发明属于微生物检测技术领域，公开了一种Pcc胁迫下魔芋及根际土壤微生物群落变化检测方法，魔芋组织内生微生物DNA提取、PCR扩增和测序；魔芋土壤微生物DNA提取、PCR扩增和测序；下机数据的质控与分析，原始测序序列使用Trimmomatic软件质控，用FLASH软件进行序列拼接；线性判别分析结合效应大小测量分析用于使用LEfSe软件搜索不同处理之间的统计学上不同的生物标志物，使用PICRUSt软件对各样本内生细菌群体进行功能预测。魔芋相关微生物群落动态的变化和组装参与了对Pcc胁迫的响应，A.muelleri倾向于招募更多的有益微生物来参与Pcc胁迫的应答。
发明专利
CN202311422420.4
2023-10-31
CN117683861A
2024-03-12
C12Q1/686(2018.01)
昆明学院
余磊;黄飞燕;郭建伟;齐颖;赵永腾;高鹏华;李丽芳;杨敏;刘佳妮;陈泽斌;余亚军;林登智;寸德馨
650214 云南省昆明市经济技术开发区浦新路2号
北京子焱知识产权代理事务所(普通合伙)
刘萍
云南;53
1.一种Pcc胁迫下魔芋及根际土壤微生物群落变化检测方法，其特征在于，所述Pcc胁迫下魔芋及根际土壤微生物群落变化检测方法，包括以下步骤： 第一步，魔芋组织内生微生物DNA提取、PCR扩增和测序； 第二步，魔芋土壤微生物DNA提取、PCR扩增和测序； 第三步，下机数据的质控与分析，原始测序序列使用Trimmomatic软件质控，用FLASH软件进行序列拼接；线性判别分析LDA结合效应大小测量LEfSe分析用于使用LEfSe软件搜索不同处理之间的统计学上不同的生物标志物，使用PICRUSt软件对各样本内生细菌群体进行功能预测。 2.如权利要求1所述的Pcc胁迫下魔芋及根际土壤微生物群落变化检测方法，其特征在于，所述第一步，具体包括：参照SPIN Kit for SoilDNA提取试剂盒的步骤对魔芋组织样本的总DNA进行提取，DNA浓度和纯度利用NanoDrop2000进行检测，利用1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量。 3.如权利要求2所述的Pcc胁迫下魔芋及根际土壤微生物群落变化检测方法，其特征在于，采用通用引物TS1 F(5’-ACTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’)和ITS2 R(5’-BGCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’)对魔芋各组织的内生真菌多样性进行分析；PCR扩增采用ProTaq,20μl反应体系：10μL 2*Pro Taq；0.8μLForward Primer(5μM)；0.8μL Reverse Primer(5μM)；10ng Template DNA；最后加ddH2O至20μL。扩增程序为：95℃预变性3min，35个循环(95℃变性30s，55℃退火30s,72℃延伸45s)，最后72℃延伸10min。 4.如权利要求3所述的Pcc胁迫下魔芋及根际土壤微生物群落变化检测方法，其特征在于，在分析内生细菌群落时，共进行两步PCR扩增：16S rRNA基因的第一次PCR扩增采用细菌引物799F(5'-AACMGGATTAGATACCCKG-3')和1392R(5'-ACGGGCGGTGTGTRC-3')进行；扩增体系TransGenAP221-02：TransStart Fastpfu DNAPolymerase，20μl反应体系：4μL 5*FastPfu Buffer；2μL2.5mM dNTPs；0.8μL Forward Primer(5μM)；0.8μL Reverse Primer(5μM)；0.4μL FastPfu Polymerase；0.2μL BSA；10ng Template DNA；最后加ddH2O至20μL。扩增程序为：95℃预变性3min，27个循环，95℃变性30s，55℃退火30s,72℃延伸45s，最后72℃延伸10min；第二次PCR扩增采用的引物是799F(5'-AACMGGATTAGATACCCKG-3')和1193R(5'-ACGTCATCCCCACCTTCC-3')(Yang et al,2022)，PCR步骤的所有条件和第一次相同，只是热循环仅进行了13个循环；使用2％琼脂糖凝胶回收PCR产物，并根据制造商的说明使用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit试剂盒进一步纯化后，送上海美吉生物医药科技有限公司在Illumina Miseq PE300平台进行测序。 5.如权利要求1所述的Pcc胁迫下魔芋及根际土壤微生物群落变化检测方法，其特征在于，所述第二步，具体包括：参照SPIN Kit for Soil土壤基因组DNA提取试剂盒的步骤提取各土壤样品DNA，DNA浓度和纯度利用NanoDrop2000进行检测，利用1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量。 6.如权利要求5所述的Pcc胁迫下魔芋及根际土壤微生物群落变化检测方法，其特征在于，细菌用通用引物338F(5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3')和806R(5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')(Wang et al.,2017)扩增16S rRNA基因的V3-V4区进行多样性分析；用通用引物TS1 F(5’-ACTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’)和ITS2 R(5’-BGCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’)(Zheng et al.,2022)对真菌多样性进行分析。 7.如权利要求6所述的Pcc胁迫下魔芋及根际土壤微生物群落变化检测方法，其特征在于，扩增体系为20μL：4μL 5*FastPfu缓冲液；2μL 2.5mmol·L-1dNTPs；0.8μL ForwardPrimer(5μmol·L-1)；0.8μL Reverse Primer(5μmol·L-1)；0.4μL FastPfu聚合酶；0.2μLBSA；10ng DNA模板；加ddH2O至20μL；扩增程序为：95℃预变性3min，27个细菌和36个真菌循环，95℃变性30s，55℃退火30s,72℃延伸45s，最后72℃延伸10min。 8.如权利要求1所述的Pcc胁迫下魔芋及根际土壤微生物群落变化检测方法，其特征在于，所述第三步，下机数据的质控与分析具体包括： 原始测序序列使用Trimmomatic软件质控，用FLASH软件进行序列拼接；通过Usearch软件过滤得到的序列，并去除嵌合体序列得到有效序列；用Uparse软件在97％的相似性水平上划分操作分类单元；代表序列用RDP classifier软件和SILVA数据库进行物种注释，利用Mothur软件作稀释度曲线，计算文库覆盖率Coverage，Shannon、Simpson、ACE及Chao1指数，对物种的多样性和丰富度指数进行评价，利用Qiime软件建立的Bray-Curtis距离算法进行主坐标分析PCoA；Circos图是使用Circos-0.67-7软件构建的；线性判别分析LDA结合效应大小测量LEfSe分析用于使用LEfSe软件搜索不同处理之间的统计学上不同的生物标志物；使用PICRUSt软件对各样本内生细菌群体进行功能预测。 9.如权利要求1所述的Pcc胁迫下魔芋及根际土壤微生物群落变化检测方法，其特征在于，所述Pcc胁迫下魔芋及根际土壤微生物群落变化检测方法的魔芋内生微生物和根际土壤微生物的分离验证，包括： (1)内生微生物的分离和纯化，将来自不同Pcc侵染阶段的魔芋组织样品进行表面消毒以去除表面微生物，先用75％乙醇冲洗所有样品2min，再用NaClO表面消毒1min，最后用无菌水冲洗10次以去除消毒剂残留物；用于表面消毒的NaClO浓度取决于植物组织，0.1％用于叶片，0.3％用于叶柄，0.5％用于根，将最后一次清洗液10μl接种在PDA固体培养基上，置于28℃培养箱培养2-3d检查是否有菌落长出；去除表面微生物后用无菌滤纸吸干表面水分，然后用无菌解剖刀将组织切成0.5cm×0.5cm的小块，放置在事先准备好的孟加拉红和NA固体培养基上，每皿放3～5块，然后置于28℃恒温培养箱中暗培养；每天观察培养皿上是否有不同的菌落产生，待长出菌落后将其挑到新的孟加拉红和NA培养基上进行纯化； (2)可培养土壤微生物的分离和纯化，采用稀释涂布平板法分离来自不同Pcc侵染阶段两种魔芋根际土壤中的可培养细菌和真菌群落；具体方法如下：称取10g土壤样品加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，放在摇床上振荡30min，使土样均匀地分散在稀释液中成为土壤悬浮液；按10倍稀释法稀释到10-2、10-3、10-4，分别吸取100μL悬浮液均匀的涂布于孟加拉红和NA固体培养基上，每个处理重复3次；细菌于28℃恒温培养2～3d，真菌于28℃恒温培养3～5d，当培养基上长出明显菌落时，挑取形态不同的菌落进行纯化培养。 10.如权利要求1所述的Pcc胁迫下魔芋及根际土壤微生物群落变化检测方法，其特征在于，所述Pcc胁迫下魔芋及根际土壤微生物群落变化检测方法的内生和土壤微生物中Pcc拮抗菌的筛选和评价，包括： (1)拮抗细菌群落的筛选和评价，活化菌株和菌液制备，将从不同处理魔芋组织以及根际土壤中分离得到的供试细菌和软腐病病原菌Pcc分别接种于LB液体培养基中摇培48h，然后用无菌蒸馏水稀释至细胞浓度为1×108CFU/mL，备用； 拮抗细菌筛选及拮抗能力评价取200μLPcc菌液均匀涂布于NA固体培养基上，将25μL供试细菌菌液接种于平板中央，同时接种无菌水作为对照，每个处理重复三次，接种后于28℃恒温培养培养24h后采用十字交叉法测量抑菌圈直径与菌落直径，计算相对抑制比值及抑菌谱带大小； 相对抑制比值＝抑菌圈直径/菌落直径； (2)拮抗真菌群落的筛选和评价，活化菌株和菌饼制备，将从不同处理魔芋组织以及根际土壤中分离得到的供试真菌接种于PDA培养基上活化2～3天后，得到无污染的菌落；将活化好的真菌用挑针挑取少量菌体置于PDA培养基上，28℃恒温倒置培养7～8d，然后用打孔器打成直径7mm菌饼，备用； 拮抗真菌筛选及拮抗能力评价取200μLPcc菌液均匀涂布于PDA固体培养基上，将制备好的7mm供试真菌菌饼正面向下放置于PDA平板中，每皿放置3个菌饼，接种后置于28℃恒温培养24h～48h后采用十字交叉法测量抑菌圈直径与菌落直径，计算相对抑制比值及抑菌谱带大小。