PCR仪单通道单管检测至少四个待测目标核酸序列的方法及其应用
本发明提供PCR仪单通道单管检测至少四个待测目标核酸序列的方法，所述方法在检测至少四个待测目标核酸序列时，将所述至少四个待测目标核酸序列分成二组，每组检测至少二个待测目标核酸序列，一组通过PCR探针熔解曲线法进行检测，所述至少二个待测目标核酸序列Tm值范围在50‑70℃；另一组通过PCR扩增产物的熔解曲线法进行检测，所述至少二个待测目标核酸序列Tm值范围在70‑90℃。本发明利用基于产物的熔解曲线和基于荧光探针的熔解曲线进行结合，检测Tm范围更广，单管单通道可实现更多重的靶标检测。
发明专利
CN202311394507.5
2023-10-25
CN117431303A
2024-01-23
C12Q1/686(2018.01)
江苏宏微特斯医药科技有限公司
胡小许;杨红雷;常沙沙;陶海霞;郭淑婷;南保林
226499 江苏省南通市如东县掘港街道珠江路888号(如东高新区生命健康产业园)
北京玄法律师事务所
潘满根
江苏;32
1.PCR仪单通道单管检测至少四个待测目标核酸序列的方法，其特征在于，所述方法在检测至少四个待测目标核酸序列时，将所述至少四个待测目标核酸序列分成二组，每组检测至少二个待测目标核酸序列，一组通过PCR探针熔解曲线法进行检测，所述至少二个待测目标核酸序列Tm值范围在50-70℃，且各个待测目标核酸序列PCR探针熔解曲线法中Tm值彼此相差至少3℃；另一组通过PCR扩增产物的熔解曲线法进行检测，所述至少二个待测目标核酸序列Tm值范围在70-90℃，且各个待测目标核酸序列PCR扩增产物的熔解曲线法中Tm值彼此相差至少3℃。 2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，通过PCR探针熔解曲线法进行检测时，针对每个待测目标核酸序列设计特异性上游、下游引物和探针，所述探针上包括荧光报告基团和淬灭基团修饰，并对探针进行修饰以调节探针的Tm，所述修饰方式包括间臂类修饰、MGB修饰和/或LNA修饰，其中通过间臂类修饰来降低待测目标核酸序列的Tm值，而通过MGB或LNA的修饰来提高待测目标核酸序列的Tm值。 3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述间臂类修饰是iSp18修饰、iSpC12修饰、iSp9修饰或iSpC6修饰。 4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述间臂类修饰位置是在所述探针序列5’端至探针序列中间位置。 5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述间臂类修饰基团的数量为1-4个。 6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，PCR扩增产物的熔解曲线法进行检测中探针含至少1个RNA碱基，在所述RNA碱基左侧靠近所述探针5’端一侧的探针碱基上标记荧光基团，在所述RNA碱基靠近所述探针3’端一侧的探针碱基上标记淬灭基团；在所述RNA碱基的左侧所述探针片段熔点Tm值高于在所述RNA碱基的右侧所述探针片段熔点Tm值。 7.试剂盒，其在权利要求1-6任一所述方法中应用。 8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒是用于检测HPV16，18，31，33，35型的试剂盒，其中HPV16、HPV18通过PCR探针熔解曲线法进行检测，HPV31、HPV33和HPV35通过PCR扩增产物的熔解曲线法进行检测，它们相应的引物和探针如下：