17β-羟基类固醇脱氢酶突变体及其在制备甾体激素中的应用
本发明公开了一种17β‑羟基类固醇脱氢酶突变体及其在制备甾体激素宝丹酮中的应用。本发明将来源于Brettanomyces naardenensis的17β‑羟基类固醇脱氢酶（17β‑HSDbn）进行突变得到突变体17β‑HSDbnN222W、17β‑HSDbnG151Y、17β‑HSDbnF212I，分别于重组大肠杆菌中进行异源表达，其酶活较野生型17β‑HSDbn提高了1.7~2.4倍。本发明进一步将上述突变体应用于Mycobacterium sp.中进行异源表达，所构建的基因工程菌其宝丹酮产量均有较大提升，更适合工业应用，可降低宝丹酮的生产成本，进一步提高生产效率。
发明专利
CN202311390497.8
2023-10-25
CN117448292A
2024-01-26
C12N9/04(2006.01)
浙江工业大学
张博;朱四方;柳志强;郑裕国
310014 浙江省杭州市拱墅区潮王路18号
浙江千克知识产权代理有限公司
冷红梅
浙江;33
1.17β-羟基类固醇脱氢酶突变体，其特征在于，由氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的17β-羟基类固醇脱氢酶经下列之一的突变所得： (1)第222位天冬酰胺突变为色氨酸； (2)第151位甘氨酸突变为酪氨酸； (3)第212位苯丙氨酸突变为异亮氨酸。 2.如权利要求1所述的17β-羟基类固醇脱氢酶突变体，其特征在于，所述17β-羟基类固醇脱氢酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。 3.如权利要求1所述的17β-羟基类固醇脱氢酶突变体，其特征在于，所述17β-羟基类固醇脱氢酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。 4.如权利要求1所述的17β-羟基类固醇脱氢酶突变体，其特征在于，所述17β-羟基类固醇脱氢酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。 5.编码权利要求1～4任一所述的17β-羟基类固醇脱氢酶突变体的基因。 6.含有权利要求5所述编码基因的重组载体。 7.含有权利要求5所述编码基因的基因工程菌。 8.如权利要求7所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌的宿主菌为大肠杆菌或快速生长型分枝杆菌。 9.一种如权利要求7所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤： (1)以新金色分枝杆菌Mycobacterium sp.NRRL B-3805为底盘菌，连续敲除基因kshA1、MnOpccR、SalA，得到菌株Mn B-3805△kMS； (2)将权利要求5所述的17β-羟基类固醇脱氢酶突变体编码基因与过表达启动子以及载体连接，得到重组载体； (3)将步骤(2)中的重组载体转化到步骤(1)所述的菌株Mn B-3805△kMS中，得到所述的基因工程菌。 10.如权利要求1～4任一所述的17β-羟基类固醇脱氢酶突变体、或如权利要求6所述的重组载体、或如权利要求7～8任一所述的基因工程菌、或如权利要求9所述的构建方法构建得到的基因工程菌在制备甾体激素中的应用。