3-甾酮-delta1-脱氢酶及其在制备雌酚酮中的应用
本发明公开了一种3‑甾酮‑Δ1‑脱氢酶及其在制备雌酚酮中的应用。所述3‑甾酮‑Δ1‑脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明还公开了一种核酸、重组表达载体、转化体、制备所述3‑甾酮‑Δ1‑脱氢酶的方法、雌酚酮的制备方法和所述3‑甾酮‑Δ1‑脱氢酶、核酸、重组表达载体或转化体在制备雌酚酮中的应用。本发明提供的3‑甾酮‑Δ1‑脱氢酶在制备雌酚酮中，具有生产流程简单、投料浓度高、转化率高、收率高、产物纯度高、成本合理和环境友好的优点，有着潜在的利用价值。
发明专利
CN202311366940.8
2023-10-20
CN117448288A
2024-01-26
C12N9/02(2006.01)
湖北葛店人福药业有限责任公司
何鑫;刘明欣;汪声晨;王婷;刘林;陈海林;赵静;蔡啸;吴雪微;肖翠
436032 湖北省鄂州市葛店经济技术开发区聚贤路25号
上海弼兴律师事务所
黄益澍
湖北;42
1.一种3-甾酮-Δ1-脱氢酶，其特征在于，所述3-甾酮-Δ1-脱氢酶的氨基酸序列如SEQID NO:1所示。 2.一种分离的核酸，其特征在于，所述核酸编码如权利要求1所述的3-甾酮-Δ1-脱氢酶； 较佳地，所述核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。 3.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含如权利要求2所述的核酸； 较佳地，所述重组表达载体的骨架质粒为pET26b或pET28a。 4.一种转化体，其特征在于，所述转化体包含如权利要求2所述的核酸或如权利要求3所述的重组表达载体； 较佳地，所述转化体的底盘菌为大肠杆菌(Escherichia coli)，例如为大肠杆菌BL21(DE3)。 5.一种制备3-甾酮-Δ1-脱氢酶的方法，其特征在于，所述方法包括将如权利要求4所述的转化体在适合的培养基中生长并表达所述3-甾酮-Δ1-脱氢酶的步骤； 较佳地，所述方法包括： (1)将包含所述转化体的种子液接种于培养基中进行培养； (2)添加诱导剂，震荡培养； (3)对经步骤(2)所得的菌体进行破碎，收集上清液； 更佳地，所述方法包括以下一种或多种条件： (1)中，所述培养的温度为30-37℃，所述种子液的接种量为1-5％例如为1％，和/或所述培养基为LB培养基； (2)中，所述诱导剂为异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，所述震荡培养的温度为20-25℃，和/或所述震荡培养的时间为16-22h； (3)中，所述破碎为超声破碎，和/或所述破碎的时间为15-30min。 6.一种雌酚酮的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括将如权利要求1所述的3-甾酮-Δ1-脱氢酶或如权利要求5所述的方法制备的3-甾酮-Δ1-脱氢酶与底物接触进行反应的步骤； 所述底物为如式1所示的19-去甲-4-雄烯二酮(酸脱)； 7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述3-甾酮-Δ1-脱氢酶的使用形式为液态酶、固态酶、固定化酶、湿菌体或菌粉； 较佳地，所述液态酶为粗酶液，所述固态酶为酶粉。 8.如权利要求6或7所述的制备方法，其特征在于，所述3-甾酮-Δ1-脱氢酶的使用形式为酶粉，反应体系中所述酶粉与所述底物的质量比为(0.01-1):1，较佳地为(0.05-0.5):1，更佳地为0.1:1； 和/或，所述底物的终浓度为10-150g/L，较佳地为100-150g/L； 和/或，所述酶粉的添加量为1-15g/L，较佳地为10-15g/L。 9.如权利要求6-8任一项所述的制备方法，其特征在于，所述反应的pH为7-8，较佳地为7.5-8； 所述反应的温度为25-35℃，较佳地为30-35℃； 和/或，反应时间为12-24h，较佳地为18h-24h； 和/或，所述制备方法包括加入电子受体，例如甲萘醌； 和/或，所述制备方法包括加入助溶剂，所述助溶剂选自DMSO、Triton-X100、吐温80和PEG-200中的一种或多种，优选为PEG-200或吐温80； 和/或，所述制备方法包括向反应体系中通氧的步骤，优选反应体系处于纯氧气氛； 和/或，所述反应结束后，还包括萃取的步骤。 10.一种如权利要求1所述的3-甾酮-Δ1-脱氢酶、如权利要求2所述的核酸、如权利要求3所述的重组表达载体、如权利要求4所述的转化体在制备雌酚酮中的应用。