Mei1基因敲除小鼠模型的构建方法和应用
本申请涉及生物技术领域，具体涉及一种Mei1基因敲除小鼠模型的构建方法和应用，本申请所述Mei1基因敲除小鼠模型的构建方法包括采用CRISPR/Cas9系统靶向敲除小鼠Mei1基因，包括：将sgRNA和Cas9 mRNA显微注射入小鼠受精卵，将小鼠受精卵移植入假孕母鼠体内，制得F0代小鼠；使用F0代小鼠构建Mei1基因敲除小鼠模型；所述sgRNA包括sgRNA1和sgRNA2；所述sgRNA1包含如SEQ ID No.1所示的序列；所述sgRNA2包含如SEQ ID No.2所示的序列。本申请的构建方法简单高效，特异性强，该方法制得的Mei1基因敲除小鼠模型的可用于筛选治疗精子发生障碍的药物。
发明专利
CN202311366218.4
2023-10-20
CN117431270A
2024-01-23
C12N15/85(2006.01)
中信湘雅生殖与遗传专科医院有限公司%湖南光琇高新生命科技有限公司
蒙岚岚;谭跃球;谭琛;徐西林;袁诗敏;涂超峰;何文斌;林戈;卢光琇
410000 湖南省长沙市高新开发区桐梓坡西路567号;
华进联合专利商标代理有限公司
张梅
湖南;43
1.Mei1基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，采用CRISPR/Cas9靶向敲除小鼠的Mei1基因，包括： 将sgRNA和Cas9 mRNA显微注射入小鼠受精卵，将小鼠受精卵移植入假孕母鼠体内，制得F0代小鼠； 使用F0代小鼠构建Mei1基因敲除小鼠模型； 所述sgRNA包括sgRNA1和sgRNA2； 所述sgRNA1包含如SEQ ID No.1所示的序列； 所述sgRNA2包含如SEQ ID No.2所示的序列。 2.如权利要求1所述Mei1基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述sgRNA靶向Mei1基因的第5号内含子和第20号内含子。 3.如权利要求1或2所述Mei1基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述sgRNA和所述Cas9 mRNA的制备方法包括： 根据所述sgRNA的序列构建sgRNA/Cas9表达载体，采用所述sgRNA/Cas9表达载体进行体外转录，制得所述sgRNA和所述Cas9 mRNA。 4.如权利要求1或2所述Mei1基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，使用F0代小鼠构建Mei1基因敲除小鼠模型包括： 对所述F0代小鼠进行鉴定，选取鉴定结果为阳性的小鼠与野生型小鼠进行杂交，制得F1代小鼠； 对所述F1代小鼠进行鉴定，选取鉴定结果为阳性的小鼠进行自交，制得F2代小鼠； 筛选所述F2代小鼠中Mei1基因敲除的纯合型小鼠，构建所述Mei1基因敲除小鼠模型。 5.如权利要求4所述Mei1基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，筛选所述F2代小鼠中Mei1基因敲除的纯合型小鼠包括： 提取所述F2代小鼠的DNA； 采用引物组合物进行PCR反应，得到PCR反应产物； 对所述PCR反应产物进行电泳测定，得到不同条带的电泳测定的结果； 根据所述电泳测定的结果鉴定所述F2代小鼠基因型； 所述引物组合物包括引物F1、引物R1和引物R2； 所述引物F1的序列包含如SEQ ID No.3所示的序列， 所述引物R1的序列包含如SEQ ID No.4所示的序列， 所述引物R2的序列包含如SEQ ID No.5所示的序列。 6.如权利要求5所述Mei1基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述引物F1和引物R1位于Mei1基因敲除区域的两端； 所述引物R2位于Mei1基因敲除区域内。 7.如权利要求5或6所述Mei1基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述不同条带的电泳测定的结果包括：仅出现673 bp条带、同时出现424 bp条带和673 bp条带或者仅出现424 bp的条带； 进一步，所述根据电泳测定的结果鉴定所述F2代小鼠基因型包括： 如果仅出现673 bp条带，则鉴定所述F2代小鼠的基因型为野生型； 如果同时出现424 bp条带和673 bp条带，则鉴定所述F2代小鼠的基因型为杂合型； 如果仅出现424 bp的条带，则鉴定所述F2代小鼠的基因型为Mei1基因敲除的纯合型。 8.如权利要求5或6所述Mei1基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，采用引物组合物进行PCR反应包括： 将PCR反应体系在94.8℃~95.2℃反应4min~6min，再在93.8℃~94.2℃反应20s~40s，再在58℃~62℃反应20s~40s，再在71℃~73℃反应5min~6min，再在3℃~5℃反应55min~65min。 9.如权利要求8所述Mei1基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述PCR反应体系包括：8μmol/L~12μmol/L的所述引物F1、8μmol/L~12μmol/L的所述引物R1和8μmol/L~12μmol/L的所述引物R2。 10.权利要求1~9任一项所述的Mei1基因敲除小鼠模型在药物筛选中的应用，其特征在于，所述药物包括治疗精子发生障碍的药物。