NK细胞外泌体在肿瘤治疗中的应用
本发明提供了NK细胞外泌体在肿瘤治疗中的应用，本发明是改良了传统的NK细胞外泌体的制备方法，通过与肿瘤细胞共培养技术实现NK细胞的体外增殖，并通过超速离心手段制备获得NK细胞外泌体。经验证，本发明制备得到的NK细胞外泌体保留了NK细胞杀伤活性的标志分子，对肿瘤细胞具备较强的杀伤性能，可有效用于各种类型的肿瘤治疗。
发明专利
CN202311359309.5
2023-10-20
CN117402823A
2024-01-16
C12N5/0783(2010.01)
广东齐美生命医学技术研究院%广东齐美医药生物科技集团有限公司%珠海齐美干细胞库有限公司%广东斯旦福国际干细胞医学研究院
顾超;张硕涵;王超
523000 广东省东莞市松山湖园区新城路9号6栋115室;;;
北京国审领航知识产权代理事务所(特殊普通合伙)
唐昱庆
广东;44
1.一种NK细胞外泌体的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤： 1）从健康受试者的外周血中分离得到外周血单个核细胞； 2）将步骤1）中分离得到的外周血单个核细胞进行分选，收集富含NK细胞的细胞悬液； 3）将步骤2）得到的富含NK细胞的细胞悬液与肿瘤细胞在培养基中共培养7天； 4）共培养结束后，用流式细胞术进一步分选CD3-CD56+CD16+NK细胞，并通过4℃，2000×g条件下收集细胞上清液； 5）对步骤4）中的上清液采用滤膜过滤后，进行超高速离心，离心条件为4℃，100000×g，60min，离心结束后，收集沉淀； 6）采用1×PBS重悬步骤5）中的沉淀，并再次进行超速离心，离心条件为4℃，100000×g，60min； 7）采用1×PBS重悬步骤6）中的沉淀，经滤膜过滤收集滤液即为NK细胞外泌体。 2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1）中是采用淋巴细胞分离液获得外周血单个核细胞。 3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2）是采用NK cell Biotin-AntibodyCocktail和NK cell MicroBead Cocktail（购自德国Miltenyi公司）作细胞阳性分选。 4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3）中的肿瘤细胞是选自乳腺癌细胞系、白血病细胞系、肺癌细胞系和黑色素瘤细胞系中的一种或多种。 5. 如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤3）中的乳腺癌细胞系是选择MDA-MB-231、、SKBR-3、MDA-MB-231-UR、MCF-12A、HBL101、MDA-MD-435、MCF-7、HS598T、MCF-10A、BT-20、MCF-10F、468、AU565、 ZR-75-1、 BT-483、BT-474、MDA-MB-453中的一种或多种。 6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤3）中的白血病细胞系是选自K562、U937、HL-60、ML-2、THP-1、KO52、NOMO-1中的一种或多种。 7. 如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤3）中的肺癌细胞系是选自16HBE、A549、SKMES1、NCIH460、HCC827、NCI-H1299、Calu-1、Calu-3 、LTEP-a-2、MSTO-211H、NCI-H1650、NCI-H292、T84、A-427、NCI-H1395、NCI-H1975中的一种或多种。 8.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤3）中的黑色素瘤细胞系是选自A375、MEL202、A2058、A875、B16中的一种或多种。 9. 如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤3）中的培养基是选自DMEM、RPMI 1640、F12K、B16F10-LUC中的一种或多种。 10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5）和7）中的滤膜为０.22μｍ孔径大小的滤膜。