Sf9细胞内水稻条纹病毒复制子系统及其构建方法
本发明公开了一种Sf9细胞内水稻条纹病毒复制子系统及其构建方法。所述方法先依次将优化的RSV RdRp和NP基因片段连接供体质粒pFastBacDual，转化DH10Bac细胞，通过蓝白斑筛选、PCR鉴定获得表达RdRp、NP的重组杆状病毒vAcRdRp‑NP；同时构建含有水稻条纹病毒基因组的荧光报告重组转录质粒vRNA‑mcherry‑gfp；最后将重组杆状病毒vAcRdRp‑NP感染Sf9细胞，再转染重组转录质粒vRNA‑mcherry‑gfp，成功构建RSV复制子系统。本发明首次在昆虫细胞Sf9内建立了RSV的复制子系统，在Sf9细胞内表达的RSV RdRp和NP能够催化完成病毒基因组的复制转录。
发明专利
CN202311355336.5
2023-10-19
CN117417896A
2024-01-19
C12N5/10(2006.01)
扬州大学
赵淑玲;唐诗;梁昌镛
225000 江苏省扬州市大学南路88号
南京理工大学专利中心
刘海霞
江苏;32
1. Sf9细胞内水稻条纹病毒复制子系统，其特征在于，包括： （1）感染重组杆状病毒vAcRdRp-NP稳定表达水稻条纹病毒衣壳蛋白和RNA聚合酶蛋白的Sf9细胞， （2）含有优化的水稻条纹病毒基因组的重组转录质粒， 通过将感染重组杆状病毒vAcRdRp-NP后的Sf9细胞转染重组转录质粒，构建得到水稻条纹病毒复制子系统； 所述的重组杆状病毒vAcRdRp-NP中RdRp的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示； 所述的优化的水稻条纹病毒基因组序列包括位于HH核酶和HDV核酶剪切位点之间的原始水稻条纹病毒基因组的5’端、3’端非编码区和中间的间隔序列、以及报告基因，原始水稻条纹病毒基因组选自水稻条纹病毒4条负义单链RNA的任意一条或任意两条以上的组合。 2. 根据权利要求1所述的Sf9细胞内水稻条纹病毒复制子系统，其特征在于，所述的报告基因为红色荧光蛋白mCherry基因和绿色荧光蛋白eGFP基因，红色荧光蛋白mCherry基因序列取代位点为基因组正义链ORF，绿色荧光蛋白eGFP基因序列取代位点为基因组反义链ORF。 3.根据权利要求1或2所述的Sf9细胞内水稻条纹病毒复制子系统的构建方法，其特征在于，具体步骤如下： （1）重组质粒pBD-RdRp的构建：PCR扩增SEQ ID No.1所示的优化后的水稻条纹病毒RdRp基因片段，RdRp基因片段经BamHI和NotI双酶切后连接供体质粒pFastBacDual，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，提取质粒DNA，获得酶切鉴定正确的重组质粒pBD-RdRp； （2）重组质粒pBD-RdRp-NP的构建：PCR扩增水稻条纹病毒NP基因片段，NP基因片段连接pMD19-T载体，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，提取质粒DNA，获得酶切鉴定正确的重组质粒，然后将NP基因片段从pMD19-T载体切下后连接重组质粒pBD-RdRp，转化含AcMNPVBacmid和Helper质粒的大肠杆菌DH10B，挑选阳性菌落，提取Bacmid DNA，经PCR鉴定正确获得重组Bacmid质粒； （3）将重组Bacmid质粒转染Sf9昆虫细胞，培养，收集上清，获得重组杆状病毒vAcRdRp-NP； （4）以报告基因红色荧光蛋白mCherry基因取代原始的水稻条纹病毒基因组的正义链ORF，以报告基因绿色荧光蛋白eGFP基因取代反义链 ORF，保留水稻条纹病毒基因组的5’端、3’端非编码区和中间的间隔序列，并插入自我剪切的HH核酶和HDV核酶之间，构成优化的水稻条纹病毒基因组，PCR扩增优化的水稻条纹病毒基因组序列，克隆于pIZ/V5-His 载体的IE2启动子下游，获得重组转录质粒vRNA-mcherry-gfp； （5）将重组杆状病毒vAcRdRp-NP感染Sf9细胞，感染24 h后转染重组转录质粒vRNA-mcherry-gfp，构建水稻条纹病毒复制子系统。 4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，步骤（4）中，原始的水稻条纹病毒基因组为水稻条纹病毒基因组RNA3。