crRNA组合物、获得方法及其产品和应用

摘要：

本发明公开crRNA组合物、获得方法及其产品和应用，所述crRNA组合物包括：至少三种crRNA；其中，每个所述crRNA靶向同一个靶核酸；任意两种所述crRNA靶向靶核酸的识别区域不重叠；相邻两个所述crRNA的识别区域之间存在间隔区域，所述crRNA组合物对应的靶核酸的间隔区域不少于两个。利用本发明的crRNA组合物可以准确地检测样品中的靶核酸，检出率高，假阴性率低，具有广泛适用性，尤其适用于低浓度靶核酸或者降解的靶核酸，能够有效消除降解对靶核酸检测的影响，应用价值高。

专利类型：发明专利

申请/专利号：CN202311315915.7

申请日期：2023-10-11

公开/公告号：CN117431245A

公开/公告日：2024-01-23

主分类号：C12N15/113(2010.01)

申请/专利权人:清华大学

发明/设计人:赵哲;李寅青

主申请人地址:100084 北京市海淀区清华园1号

专利代理机构:北京清亦华知识产权代理事务所(普通合伙)

代理人:金凤鸣

国别省市代码:北京;11

权利要求：

1.一种用于靶向靶核酸的crRNA组合物，其特征在于，包括：至少三种crRNA； 其中，每个所述crRNA靶向同一个靶核酸； 任意两种所述crRNA靶向靶核酸的识别区域不重叠； 相邻两个所述crRNA的识别区域之间存在间隔区域，所述crRNA组合物对应的靶核酸的间隔区域不少于两个。 2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述crRNA的识别区域长度为17～28个核苷酸，优选19～28个核苷酸； 任选地，所述间隔区域的长度不低于30个核苷酸，优选为50～250个核苷酸，更优选为100～200个核苷酸； 任选地，所述crRNA组合物对应的识别区域和间隔区域的长度之和为所述靶核酸总长度的30～100％； 任选地，所述crRNA组合物对应的识别区域和间隔区域的长度之和为所述靶核酸总长度的50～100％； 任选地，所述crRNA组合物对应的识别区域和间隔区域的长度之和为所述靶核酸总长度的60～100％。 3.根据权利要求1所述的组合物，所述靶核酸为RNA，优选来源于RNA病毒的RNA； 任选地，所述靶核酸为SARS-COV-2病毒的N基因；优选地，所述靶核酸具有如SEQ IDNO:1所示的核苷酸序列； 任选地，所述crRNA组合物包含至少三种crRNA且具有如SEQ ID NO:2～11所示的核苷酸序列中的至少三种；优选地，所述crRNA组合物为三种crRNA且具有如SEQ ID NO:2、SEQID NO:4、SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列； 任选地，所述crRNA组合物包含至少四种crRNA且具有如SEQ ID NO:2～11所示的核苷酸序列中的至少四种；优选地，所述crRNA组合物为四种crRNA且具有如SEQ ID NO:2、SEQID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列； 任选地，所述crRNA组合物包含至少五种crRNA且具有如SEQ ID NO:2～11所示的核苷酸序列中的至少五种；优选地，所述crRNA组合物为五种crRNA且具有如SEQ ID NO:2～4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列；优选地，所述crRNA组合物为五种crRNA且具有如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9～11所示的核苷酸序列； 任选地，所述crRNA组合物为十种crRNA且具有如SEQ ID NO:2～11所示的核苷酸序列。 4.一种获得用于靶向靶核酸的crRNA组合物的方法，其特征在于，包括： 提供靶核酸的序列信息； 基于靶核酸的序列信息，设计靶向靶核酸序列的多个候选crRNA； 从所述多个候选crRNA中筛选出满足条件的至少三种crRNA，作为目标crRNA： 其中，所述满足条件包括： 每个所述目标crRNA靶向同一个靶核酸； 任意两种所述目标crRNA靶向靶核酸的识别区域不重叠； 相邻两个所述目标crRNA的识别区域之间存在间隔区域，且所有目标crRNA对应的靶核酸的间隔区域不少于两个。 5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述目标crRNA的识别区域长度为17～28个核苷酸，优选19～28个核苷酸； 任选地，所述间隔区域的长度不低于30个核苷酸，优选为50～250个核苷酸，更优选为100～200个核苷酸； 任选地，所述所有目标crRNA对应的识别区域和间隔区域的长度之和为所述靶标RNA序列总长度的30～100％； 任选地，所述所有目标crRNA对应的识别区域和间隔区域的长度之和为所述靶标RNA序列总长度的50～100％； 任选地，所述所有目标crRNA对应的识别区域和间隔区域的长度之和为所述靶标RNA序列总长度的60～100％。 6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述靶核酸为RNA，优选来源于RNA病毒的RNA； 任选地，所述靶核酸为SARS-COV-2病毒的N基因；优选地，所述靶核酸具有如SEQ IDNO:1所示的核苷酸序列； 任选地，获得的crRNA组合物包括至少三种crRNA且具有如SEQ ID NO:2～11所示的核苷酸序列中的至少三种；优选地，获得的crRNA组合物为三种crRNA且具有如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列； 任选地，获得的crRNA组合物包括至少四种crRNA且具有如SEQ ID NO:2～11所示的核苷酸序列中的至少四种；优选地，获得的crRNA组合物为四种crRNA且具有如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列； 任选地，获得的crRNA组合物包括至少五种crRNA且具有如SEQ ID NO:2～11所示的核苷酸序列中的至少五种；优选地，获得的crRNA组合物为五种crRNA且具有如SEQ IDNO:2～4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列；优选地，获得的crRNA组合物为五种crRNA且具有如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9～11所示的核苷酸序列； 任选地，获得的目标crRNA组合物为十种crRNA且具有如SEQ ID NO:2～11所示的核苷酸序列。 7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述设计靶向靶核酸序列的多个候选crRNA是采用crRNA设计软件进行的； 任选地，所述crRNA设计软件是Cas13design。 8.一种用于检测样品中靶核酸的系统，其特征在于，包括： 权利要求1～3任一项所述的crRNA组合物或按照权利要求4～7任一项所述方法获得的crRNA组合物； 任选地，进一步包括：Cas蛋白和报告分子。 9.一种用于检测样品中靶核酸的组合物，其特征在于，包括： 权利要求1～3任一项所述的crRNA组合物或按照权利要求4～7任一项所述方法获得的crRNA组合物； 任选地，进一步包括：Cas蛋白和报告分子。 10.一种用于检测样品中靶核酸的试剂盒，其特征在于，包括：权利要求9所述的用于检测样品中靶核酸的组合物。 11.权利要求1～3任一项所述的crRNA组合物、权利要求8所述的系统或权利要求9所述的组合物在制备试剂盒中的应用，其特征在于，所述试剂盒用于检测样品中的靶核酸； 任选地，所述靶核酸来源于微生物、土壤、水源、动物或植物样品； 任选地，所述靶核酸来源于病毒或细菌； 任选地，所述靶核酸包括RNA、ASO和核酸适配体的至少之一； 任选地，所述靶核酸包括mRNA、miRNA和siRNA的至少之一； 任选地，所述靶核酸来源于RNA病毒的RNA； 任选地，所述靶核酸为SARS-COV-2病毒的N基因； 优选地，所述靶核酸具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。 12.一种检测样品中靶核酸的方法，其特征在于，包括： 步骤1：确定靶核酸的序列信息； 步骤2：按照权利要求4～7任一项所述方法获得的crRNA组合物或者提供权利要求1～3任一项所述的crRNA组合物； 步骤3：将所述crRNA组合物、Cas蛋白和用于产生可检测信号的报告分子进行反应，收集可检测信号； 步骤4：基于所述可检测信号，对所述靶核酸进行定性或定量分析。 13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，步骤3包括：基于权利要求8所述系统或权利要求9所述组合物或权利要求10所述试剂盒构建反应体系，进行反应，收集可检测信号。