2-O-硫酸化酶突变体和3-O-硫酸化酶突变体及其使用方法
本发明提供了表现出高活性的2‑OST突变体。具体地，本发明提供了2‑O‑硫酸化酶突变体，其在以下的任何一种氨基酸序列中具有由碱性氨基酸残基对位置321处的亮氨酸残基的取代：(a)SEQ ID NO:2的氨基酸序列；(b)氨基酸序列，其在SEQ ID NO:2的氨基酸序列中包含一个或几个氨基酸取代、缺失、插入或添加；或(c)氨基酸序列，其与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有90％或更多的同一性；或(d)氨基酸序列，其由SEQ ID NO:2的氨基酸序列中位置69至356处的氨基酸残基组成；(e)氨基酸序列，其在由SEQ ID NO:2的氨基酸序列中位置69至356处的氨基酸残基组成的氨基酸序列中包含一个或几个氨基酸取代、缺失、插入或添加；或(f)氨基酸序列，其与由SEQ ID NO:2的氨基酸序列中位置69至356处的氨基酸残基组成的氨基酸序列具有90％或更多的同一性；并且具有2‑O‑硫酸转移活性。
发明专利
CN202311171443.2
2018-09-05
CN117417912A
2024-01-19
C12N9/10(2006.01)
味之素株式会社
辻千寻;清水朋子;田上宇乃;三原康博;杉木正之;中野祥吾;本山智晴;伊藤创平
日本东京都
北京市柳沈律师事务所
张文辉
日本;JP
1.2-O-硫酸化酶突变体，其在以下的任何一种氨基酸序列中具有由碱性氨基酸残基对位置321处的亮氨酸残基的取代： (a)SEQ ID NO:2的氨基酸序列； (b)氨基酸序列，其在SEQ ID NO:2的氨基酸序列中包含一个或几个氨基酸取代、缺失、插入或添加；或 (c)氨基酸序列，其与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有90％或更多的同一性；或 (d)氨基酸序列，其由SEQ ID NO:2的氨基酸序列中位置69至356处的氨基酸残基组成； (e)氨基酸序列，其在由SEQ ID NO:2的氨基酸序列中位置69至356处的氨基酸残基组成的氨基酸序列中包含一个或几个氨基酸取代、缺失、插入或添加；或 (f)氨基酸序列，其与由SEQ ID NO:2的氨基酸序列中位置69至356处的氨基酸残基组成的氨基酸序列具有90％或更多的同一性；并且 具有2-O-硫酸转移活性。 2.根据权利要求1的2-O-硫酸化酶突变体，其中所述碱性氨基酸残基是精氨酸残基或赖氨酸残基。 3.生产己糖醛酸残基的2位处的羟基被硫酸化的经修饰的肝素前体(heparosan)化合物的方法，所述方法包括在存在2-O-硫酸化酶突变体的情况下将肝素前体化合物转化为己糖醛酸残基的2位处的羟基被硫酸化的经修饰的肝素前体化合物， 其中所述2-O-硫酸化酶突变体是在以下的任何一种氨基酸序列中具有由碱性氨基酸残基对位置321处的亮氨酸残基的取代的2-O-硫酸化酶突变体： (a)SEQ ID NO:2的氨基酸序列； (b)氨基酸序列，其在SEQ ID NO:2的氨基酸序列中包含一个或几个氨基酸取代、缺失、插入或添加；或 (c)氨基酸序列，其与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有90％或更多的同一性；或 (d)氨基酸序列，其由SEQ ID NO:2的氨基酸序列中位置69至356处的氨基酸残基组成； (e)氨基酸序列，其在由SEQ ID NO:2的氨基酸序列中位置69至356处的氨基酸残基组成的氨基酸序列中包含一个或几个氨基酸取代、缺失、插入或添加；或 (f)氨基酸序列，其与由SEQ ID NO:2的氨基酸序列中位置69至356处的氨基酸残基组成的氨基酸序列具有90％或更多的同一性；并且 具有2-O-硫酸转移活性。 4.根据权利要求3的方法，其中所述肝素前体化合物是N-硫酸化的肝素前体、N-硫酸化的差向异构化的肝素前体、N-硫酸化的解聚的肝素前体或N-硫酸化的差向异构化的解聚的肝素前体。 5.根据权利要求3或4的方法，其中在存在生产所述2-O-硫酸化酶突变体的经转化的微生物或其提取物的情况下，生产所述己糖醛酸残基的2位处的羟基被硫酸化的肝素前体化合物。 6.根据权利要求5的方法，其中所述经转化的微生物是属于埃希氏菌属的细菌。 7.根据权利要求6的方法，其中所述属于埃希氏菌属的细菌是大肠杆菌。