Nfat5基因定点整合宿主细胞
本披露涉及Nfat5基因定点整合宿主细胞。具体而言，本披露涉及外源核苷酸基因定点整合的细胞系，制备方法及其用途。该细胞系通过在Nfat5基因插入识别标签或外源基因而获得。
发明专利
CN202311141326.1
2023-09-06
CN117660352A
2024-03-08
C12N5/10(2006.01)
江苏恒瑞医药股份有限公司%上海恒瑞医药有限公司
周松涛;岳丽云
222047 江苏省连云港市经济技术开发区昆仑山路7号;
江苏;32
1.一种包含整合在特定位点处的外源核苷酸序列的宿主细胞，其中所述的特定位点为Nfat5基因。 2.根据权利要求1所述的宿主细胞，其中所述的特定位点为Nfat5基因的内含子；优选地，所述的特定位点为Nfat5基因的第1内含子。 3.根据权利要求1或2所述的宿主细胞，其中所述的特定位点包含如序列SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:4具有至少90％序列同一性的核苷酸序列； 优选地，所述的特定位点为如序列SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列； 更优选地，所述的特定位点为如序列SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。 4.根据权利要求1-3中任一项所述的宿主细胞，其中所述外源核苷酸序列包括至少2个重组识别序列，位于编码目标序列的基因的侧翼； 优选地，其中所述重组识别序列包含了可被酪氨酸重组酶识别的位点如FRT位点或lox位点；或可被丝氨酸重组酶识别的序列如att位点； 更优选地，所述重组识别序列选自以下各项组成的群组：loxP位点、lox511位点、lox2272位点、lox2372位点、lox5171位点、loxm2位点、lox71位点、lox66位点、loxFas位点、attP、attB位点和野生型FRT、FRT3和FRT5位点； 最优选地，所述重组识别序列为loxP和lox 2272位点。 5.根据权利要求1-4中任一项所述的宿主细胞，其中所述的外源核苷酸序列包含一个或多个选自编码筛选标记物、可检测的蛋白、抗体或其抗原可结合片段、肽抗原、酶、激素、生长因子、受体、融合蛋白或其它生物活性蛋白的基因； 优选地，其中所述的外源核苷酸序列包含一个或多个编码筛选标记物，可检测的蛋白，和抗体或其抗原可结合片段的基因； 更优选地，其中所述筛选标记物选自GS选择标记物、DHFR选择标记物、遗传霉素选择标记物、新霉素选择标记物、嘌呤霉素选择标记物或胸苷激酶选择标记物，所述的可检测的蛋白是荧光标记蛋白； 最优选的，其中所述筛选标记物是新霉素选择标记物，所述的可检测的蛋白是绿荧光标记蛋白。 6.根据权利要求1-5中任一项所述宿主细胞，其中所述的外源核苷酸序列包含一个或多个抗体或其抗原可结合片段。 7.根据权利要求1至6中任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是小鼠细胞、人类细胞、CHO细胞株、CHO-K1细胞株、CHO-S细胞株、CHO-DXB11或CHO-DG44细胞株，优选CHO细胞株。 8.根据权利要求1至7中任一项所述的宿主细胞，其中所述外源核苷酸序列的包含3′端同源臂和5′端同源臂；所述的3′端同源臂与Nfat5基因的第1内含子、SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:3的核苷酸序列中所存在的序列同源，所述的5′端同源臂与Nfat5基因的第1内含子、SEQID NO:2或SEQ ID NO:3的核苷酸序列中所存在的序列同源； 优选地，所述的3′端同源臂与SEQ ID NO:32的核苷酸序列中所存在的序列同源，所述的5′端同源臂与SEQ ID NO:31的核苷酸序列中所存在的序列同源； 更优选地，所述的3′端同源臂与SEQ ID NO:34的核苷酸序列中所存在的序列同源，所述的5′端同源臂与SEQ ID NO:33的核苷酸序列中所存在的序列同源。 9.根据权利要求1至8中任一项所述的宿主细胞，其中所述外源核苷酸序列选自： a).所述外源核苷酸序列在2个同源臂之间，所述的同源臂为与SEQ ID NO:32的核苷酸序列中所存在的序列同源的3′端同源臂，和与SEQ ID NO:31的核苷酸序列中所存在的序列同源的5′端同源臂， 两个重组识别序列loxP和lox 2272位点； 启动子，筛选标记物基因和/或抗性基因；或 b).所述外源核苷酸序列包括2个同源臂，所述的同源臂为与SEQ ID NO:34的核苷酸序列中所存在的序列同源的3′端同源臂，和与SEQ ID NO:33的核苷酸序列中所存在的序列同源的5′端同源臂， 两个重组识别序列loxP和lox 2272位点； 启动子，抗体或其抗原可结合片段的基因。 10.根据权利要求1至9中任一项所述的宿主细胞，其中所述外源核苷酸序列包括选自如下所示的c)、d)和e)： c). -loxP-EF1αPromoter-ZsGreen1-bGHpolyA-SV40-NeoR-lox2272-；和 d). -loxp-CMV-LC-bGHpolyA-CMV-HC-lox2272-； 优选地，其中的LC为如SEQ ID NO:40的编码抗体轻链的核苷酸序列，HC为如SEQ IDNO:41的编码抗体重链的核苷酸序列；或者其中的LC为如SEQ ID NO:62的编码抗体轻链的核苷酸序列，HC为如SEQ ID NO:63的编码抗体重链的核苷酸序列； e)-loxp-CMV-LC1-bGHpolyA-CMV-HC1-bGHpolyA-CMV-LC2-bGHpolyA-CMV-HC2-lox2272- 优选地，其中的LC1为如SEQ ID NO:64的编码抗体轻链的核苷酸序列，HC1为如SEQ IDNO:65的编码抗体重链的核苷酸序列，LC2为如SEQ ID NO:66的编码抗体轻链的核苷酸序列，HC2为如SEQ ID NO:67的编码抗体重链的核苷酸序列。 11.一种表达目标产物的宿主细胞的构建方法，所述方法包含将外源核苷酸引入到细胞内的内源Nfat5基因；优选地，包含将外源核苷酸引入到细胞内的内源Nfat5基因的内含子中；更优选地，包含将外源核苷酸引入到细胞内的内源Nfat5基因的第1内含子中。 12.根据权利要求11所述的宿主细胞的构建方法，其中所述的外源核苷酸序列包含一个或多个选自编码筛选标记物、可检测的蛋白、抗体或其抗原可结合片段、肽抗原、酶、激素、生长因子、受体、融合蛋白或其它生物活性蛋白的基因； 优选地，其中所述的外源核苷酸序列包含一个或多个选自编码筛选标记物，可检测的蛋白，和抗体或其抗原可结合片段的基因。 13.根据权利要求11所述的宿主细胞的构建方法，包括： 步骤1、将外源核苷酸序列筛选标记物基因和可检测的蛋白基因引入到细胞内的内源Nfat5基因中； 步骤2、将外源核苷酸序列抗体或其抗原可结合片段的基因用基因重组替换的方法，替换筛选标记物基因和可检测的蛋白基因，引入到细胞内的内源Nfat5基因中； 优选地，方法包括： 步骤1、将外源核苷酸序列筛选标记物基因和可检测的蛋白基因引入到细胞内的内源Nfat5基因的内含子中； 步骤2、将外源核苷酸序列抗体或其抗原可结合片段的基因用基因重组替换的方法，替换筛选标记物基因和可检测的蛋白基因，引入到细胞内的内源Nfat5基因的内含子中； 更优选地，方法包括： 步骤1、将外源核苷酸序列筛选标记物基因和可检测的蛋白基因引入到细胞内的内源Nfat5基因的第1内含子中； 步骤2、将外源核苷酸序列抗体或其抗原可结合片段的基因用基因重组替换的方法，替换筛选标记物基因和可检测的蛋白基因，引入到细胞内的内源Nfat5基因的第1内含子中。 14.根据权利要求11所述的宿主细胞的构建方法，包括： 步骤1、构建SgRNA质粒、Cas 9质粒和供体质粒导入所述CHO细胞； 步骤2、构建包含目标蛋白基因的表达盒质粒； 步骤3、通过盒式交换将表达盒质粒中的目标蛋白基因替换供体质粒基因，得到表达目标蛋白的细胞株； 其中所述的SgRNA质粒包含选自Nfat5基因第1内含子、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3上的识别位点序列SEQ ID NO:5，优选SEQ ID NO:9； 其中所述的供体质粒包括位于Nfat5基因第1内含子的3′同源臂和5′同源臂；两个重组识别位点，启动子，终止子，抗性基因和绿色荧光基因； 其中所述的表达盒质粒包括两个重组识别位点，启动子，终止子，和目标蛋白； 优选地，所述的目标蛋白为抗体； 更优选地，所述的目标蛋白选自以下核苷酸编码的抗体： 由核苷酸序列SEQ ID NO:40编码的抗体轻链，和核苷酸序列SEQ ID NO:41编码的抗体重链得到的单克隆抗体； 或由核苷酸序列SEQ ID NO:62编码的抗体轻链，和核苷酸序列SEQ ID NO:63编码的抗体重链得到的单克隆抗体； 或由核苷酸序列SEQ ID NO:64编码一个抗体轻链，核苷酸序列SEQ ID NO:65编码一个抗体重链，核苷酸序列SEQ ID NO:66编码另一抗体轻链，核苷酸序列SEQ ID NO:67编码另一抗体重链，获得的双特异性抗体。 15.根据权利要求14所述的宿主细胞的构建方法，其中所述的3′端同源臂与Nfat5基因第1内含子、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的核苷酸序列中所存在的序列同源，所述的5′端同源臂与Nfat5基因第1内含子、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的核苷酸序列中所存在的序列同源； 优选地，所述的3′端同源臂与SEQ ID NO:32的核苷酸序列中所存在的序列同源，所述的5′端同源臂与SEQ ID NO:31的核苷酸序列中所存在的序列同源； 更优选地，所述的3′端同源臂与SEQ ID NO:34的核苷酸序列中所存在的序列同源，所述的5′端同源臂与SEQ ID NO:33的核苷酸序列中所存在的序列同源； 最优选地，所述3′同源臂为Cas 9断裂位点SEQ ID NO:9右侧的序列，所述5′同源臂为Cas 9断裂识别位点SEQ ID NO:9左侧的序列。