OpCBR1转录因子在提高短小蛇根草毛状根生长和增加喜树碱产量中的应用
本发明提供了一种OpCBR1转录因子在提高短小蛇根草毛状根生长和增加喜树碱产量中的应用，通过构建含OpCBR1基因的植物表达载体并遗传转化短小蛇根草茎段外植体，获得过量表达OpCBR1基因的短小蛇根草毛状根；利用称重法和高效液相色谱法分析转基因毛状根的生物量和喜树碱的产量，结果表明过量表达OpCBR1基因可以通过提高短小蛇根草毛状根的生物量从而提高其喜树碱产量；通过动态观察发现，OpCBR1的转基因株系毛状根的生物量在第16天显著提高，在32天就已经达到了最大值，同时产量也达到了最大值，表明过量表达OpCBR1基因能明显缩短培养周期。本发明为生产具有广谱抗癌疗效的喜树碱提供了一种新型优质药源，具有重要的理论意义和潜在的应用价值。
发明专利
CN202311058300.0
2023-08-22
CN117327726A
2024-01-02
C12N15/82(2006.01)
浙江中医药大学
开国银;周钦;郝小龙;李勇鹏;王静宜
310053 浙江省杭州市滨江区滨文路548号
杭州求是专利事务所有限公司
邱启旺
浙江;33
1.一种OpCBR1转录因子在提高短小蛇根草毛状根生长和增加喜树碱产量中的应用，其特征在于，在短小蛇根草中过表达OpCBR1转录因子，所述OpCBR1转录因子的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。 2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述在短小蛇根草中过表达OpCBR1转录因子具体为： 将含OpCBR1转录因子的植物过表达载体转化发根农杆菌，得到具有所述植物过表达载体的发根农杆菌菌株； 利用构建的所述发根农杆菌菌株转化短小蛇根草外植体，经抗生素筛选得到抗性毛状根，再经PCR检测为阳性的毛状根株系即获得在短小蛇根草中过表达OpCBR1转录因子的转基因短小蛇根草毛状根。 3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述含OpCBR1转录因子的植物过表达载体包含如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。 4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述发根农杆菌为C58C1菌株。 5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述经抗生素筛选得到抗性毛状根具体为： 将转化后的短小蛇根草外植体放置于B5培养基表面，28℃条件下暗培养2天，转移至一级除菌固体培养基，在25℃条件下暗培养，每隔2周更换一次培养基，直至外植体的愈伤组织处长出毛状根，再转移至二级除菌固体培养基进行25℃暗培养，直至毛状根长至3-4cm，并且开始出现分支，此时，将长势较好且带有分支的毛状根单克隆从愈伤组织上剪下，转移至三级除菌固体培养基上25℃暗培养；在培养一段时间后，在三级除菌固体培养基上选择生长状态良好，并且没有出现溢菌现象的克隆株系，从这些克隆株系上剪下新长出尖端的毛状根，将其转入B5固体培养基中继续25℃暗培养，获得抗性毛状根；其中一级除菌固体培养基为B5+Cb300mg/L，二级除菌固体培养基为B5+Cb 200mg/L，三级除菌固体培养基为B5+Cb 100mg/L。 6.一种利用OpCBR1转录因子提高短小蛇根草毛状根生长和增加喜树碱产量的方法，其特征在于，包括以下步骤： 步骤1、将OpCBR1转录因子可操作性地连接于表达调控序列，形成含OpCBR1基因的植物过表达载体；其中OpCBR1转录因子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示； 步骤2、将含OpCBR1基因的植物过表达载体转化发根农杆菌，得到具有所述植物过表达载体的发根农杆菌菌株； 步骤3、利用步骤2中构建的所述发根农杆菌菌株转化短小蛇根草外植体，经抗生素筛选得到抗性毛状根，再经PCR检测为阳性的毛状根株系即为转基因短小蛇根草毛状根，转基因短小蛇根草毛状根具有更快的生长速度和更高的喜树碱产量。 7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤2中，采用冻融法进行转入，所述发根农杆菌为C58C1菌株。 8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤3中，经抗生素筛选得到抗性毛状根具体为： 将转化后的短小蛇根草外植体放置于B5培养基表面，28℃条件下暗培养2天，转移至一级除菌固体培养基，在25℃条件下暗培养，每隔2周更换一次培养基，直至外植体的愈伤组织处长出毛状根，再转移至二级除菌固体培养基进行25℃暗培养，直至毛状根长至3-4cm，并且开始出现分支，此时，将长势较好且带有分支的毛状根单克隆从愈伤组织上剪下，转移至三级除菌固体培养基上25℃暗培养；在培养一段时间后，在三级除菌固体培养基上选择生长状态良好，并且没有出现溢菌现象的克隆株系，从这些克隆株系上剪下新长出尖端的毛状根，将其转入B5固体培养基中继续25℃暗培养，获得抗性毛状根；其中一级除菌固体培养基为B5+Cb 300mg/L，二级除菌固体培养基为B5+Cb 200mg/L，三级除菌固体培养基为B5+Cb 100mg/L。