pcDNA3.1(+)-HOXA1真核表达载体、构建方法及其应用
本发明提供一种pcDNA3.1(+)‑HOXA1真核表达载体、构建方法及其应用，涉及生物技术领域；方法包括：1)体外合成HOXA1基因全长，PCR扩增目的基因；2)将pcDNA3.1(+)质粒进行双酶切处理；3)HOXA1基因PCR产物与pcDNA3.1(+)载体进行重组克隆；4)将重组质粒转化感受态细胞，菌液PCR筛选阳性克隆，并进行测序鉴定；5)抽提pcDNA3.1(+)‑HOXA1重组质粒。本发明将上述方法得到的pcDNA3.1(+)‑HOXA1真核表达载体转染至肺癌来源MDSCs，通过验证pcDNA3.1(+)‑HOXA1的表达效率，有效明确HOXA1基因对肺癌MDSCs功能的调控作用。
发明专利
CN202311028155.1
2023-08-16
CN117646031A
2024-03-05
C12N15/85(2006.01)
南京鼓楼医院
田新宇;郑齐锶;沈瀚;宁明哲;陶月
210008 江苏省南京市鼓楼区中山路321号南京鼓楼医院
南京九致知识产权代理事务所(普通合伙)
王晓青
江苏;32
1.一种pcDNA3.1(+)-HOXA1真核表达载体，其特征在于，所述真核表达载体包含HOXA1基因和氨苄青霉素筛选标签；具体为，以含氨苄青霉素筛选标签的pcDNA3.1(+)质粒为载体，在pcDNA3.1(+)质粒的限制性酶切位点BamHI和EcoRI之间插入HOXA1基因，获得所述真核表达载体。 2.根据权利要求1所述的pcDNA3.1(+)-HOXA1真核表达载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤： 1)以体外获得的人HOXA1基因全长为模板，使用高保真酶进行PCR扩增，获得目的基因； 2)采用限制性核酸内切酶BamHI、EcoRI对pcDNA3.1(+)质粒进行双酶切处理，提取酶切片段； 3)将目的基因与双酶切处理后的pcDNA3.1(+)质粒进行重组克隆，获得包含HOXA1基因的pcDNA3.1(+)-HOXA1重组质粒； 4)将pcDNA3.1(+)-HOXA1重组质粒转化感受态细胞，菌落PCR筛选阳性克隆，抽提pcDNA3.1(+)-HOXA1重组质粒； 5)对抽提的pcDNA3.1(+)-HOXA1重组质粒进行DNA测序分析，选取双向测序模式，使用pcDNA3.1(+)质粒通用引物横跨质粒的多克隆位点区逐个碱基检测，检测结果与HOXA1基因序列进行比对。 3.根据权利要求2所述pcDNA3.1(+)-HOXA1真核表达载体的构建方法，其特征在于，所述步骤1)中使用高保真酶进行PCR扩增的过程为： 根据HOXA1基因的基因序列设计PCR引物，包括上游引物HOXA1-P1和下游引物HOXA1-P2；其中，所述上游引物HOXA1-P1的序列为： 5’-CTTGGTACCGAGCTCGGATCCATCATTTTTCTTCTCCGGCCCCA-3’， 所述下游引物HOXA1-P2的序列为： 5’-TGCTGGATATCTGCAGAATTCTTTTGGCTTTTGAAGGGAGTTCTGTT-3’； 构建PCR反应体系，所述PCR反应体系包括：ddH2O 32μL，10×PCR缓冲液5μL，浓度为2.5mM的dNTP Mix 5μL，浓度为25mM的MgSO4 3μL，浓度为10μM的上游引物HOXA1-P1 1.5μL，浓度为10μM的下游引物HOXA1-P21.5μL，浓度为10ng/μL的模板1μL，浓度为1U/μL的KOD-Plus-Neo 1μL；PCR扩增条件为：98℃10s，60℃30s，68℃180s，进行30个循环。 4.根据权利要求3所述pcDNA3.1(+)-HOXA1真核表达载体的构建方法，其特征在于，所述根据HOXA1基因的基因序列设计PCR引物的原理为： 在所述上游引物HOXA1-P1和下游引物HOXA1-P2的序列5’端分别引入同源重组序列扩增目的基因片段，并使得上游引物HOXA1-P1序列的扩增产物、下游引物HOXA1-P2序列的扩增产物分别与其不线性化克隆载体两末端序列完全一致。 5.根据权利要求2所述pcDNA3.1(+)-HOXA1真核表达载体的构建方法，其特征在于，所述步骤4)菌落PCR筛选阳性克隆的扩增体系如下：包括ddH2O9.2μL，2×Taq Plus MasterMix 10μL，浓度为10μM的上游引物CMV-F 0.4μL，浓度为10μM的下游引物BGH-R 0.4μL，单菌落；菌落PCR扩增条件为：94℃30s，57℃30s，72℃180s，进行25个循环； 其中，所述上游引物CMV-F序列为：5’-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3’；所述下游引物BGH-R序列为：5’-TAGAAGGCACAGTCGAGG-3’。 6.根据权利要求1所述pcDNA3.1(+)-HOXA1真核表达载体在调控肺癌来源MDSCs功能中的应用。 7.根据权利要求6所述pcDNA3.1(+)-HOXA1真核表达载体在调控肺癌来源MDSCs功能中的应用，其特征在于，包括如下步骤： 1)获取肺癌患者肿瘤组织的细胞悬液； 2)采用流式细胞术，分选人CD33+CD11b+HLA-DR-MDSCs； 3)将pcDNA3.1(+)-HOXA1真核表达载体转染至人CD33+CD11b+HLA-DR-MDSCs； 4)检测人CD33+CD11b+HLA-DR-MDSCs中效应分子ARG-1的水平。 8.根据权利要求1所述pcDNA3.1(+)-HOXA1真核表达载体在肺癌治疗药物中的应用。