PEDV、PDCoV和RV-A三重荧光定量RT-qPCR检测试剂盒

摘要：

本发明公开了一种对猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪德尔塔型冠状病毒(PDCoV)、猪轮状病毒A型(RV‑A)同时进行三重荧光定量RT‑qPCR检测试剂盒，该试剂盒包括：用于扩增PEDV目标基因片段的引物组、用于检测PEDV的探针；用于扩增PDCoV目标基因片段的引物组、用于检测PDCoV的探针；以及用于扩增RV‑A目标基因片段的引物组、用于检测RV‑A的探针。实验表明，本发明的三重RT‑qPCR试剂的检测灵敏度与单重RT‑qPCR试剂的检测结果无差异，具备高灵敏性、高特异性、低污染和实时检测的优势，可为一线猪场临床腹泻病毒病的预警、早期诊断和防治监测提供可靠的技术和产品。

专利类型：发明专利

申请/专利号：CN202310916923.0

申请日期：2023-07-25

公开/公告号：CN117327838A

公开/公告日：2024-01-02

主分类号：C12Q1/70(2006.01)

申请/专利权人:广州市益豚猪业投资有限公司

发明/设计人:张玮;廖鏖;王星晨;熊福银;吴俊果

主申请人地址:511446 广东省广州市番禺区南村镇南草堂村金坑工业区路9号3栋101-103房

专利代理机构:广州三环专利商标代理有限公司

代理人:戴建波

国别省市代码:广东;44

权利要求：

1.一种对猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪德尔塔型冠状病毒(PDCoV)、猪轮状病毒A型(RV-A)同时进行三重荧光定量RT-qPCR检测试剂盒，该试剂盒包括：用于扩增PEDV目标基因片段的引物组、用于检测PEDV的探针；用于扩增PDCoV目标基因片段的引物组、用于检测PDCoV的探针；以及用于扩增RV-A目标基因片段的引物组、用于检测RV-A的探针； 其中，用于扩增PEDV目标基因片段的引物组和用于检测PEDV的探针为选自于如下设计方案中的至少一种： PEDV方案1：上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQID NO:2所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示； PEDV方案2：上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，下游引物的核苷酸序列如SEQID NO:5所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示； PEDV方案3：上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，下游引物的核苷酸序列如SEQID NO:8所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示； 其中，用于扩增PDCoV目标基因片段的引物组和用于检测PDCoV的探针为选自于如下设计方案中的至少一种： PDCoV方案1：上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示； PDCoV方案2：上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示； PDCoV方案3：上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示； 其中，用于扩增RV-A目标基因片段的引物组和用于检测RV-A的探针为选自于如下设计方案中的至少一种： RV-A方案1：上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:19所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:20所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:21所示； RV-A方案2：上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:22所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:23所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:24所示； RV-A方案3：上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:25所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:26所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:27所示。 2.如权利要求1所述的三重荧光定量RT-qPCR检测试剂盒，其中，用于扩增PEDV目标基因片段的引物组和用于检测PEDV的探针为PEDV方案2。 3.如权利要求1所述的三重荧光定量RT-qPCR检测试剂盒，其中，用于扩增PDCoV目标基因片段的引物组和用于检测PDCoV的探针为PDCoV方案3。 4.如权利要求1所述的三重荧光定量RT-qPCR检测试剂盒，其中，用于扩增RV-A目标基因片段的引物组和用于检测RV-A的探针为RV-A方案1。 5.如权利要求1所述的三重荧光定量RT-qPCR检测试剂盒，其中，所述各探针的5’端修饰有荧光报告基团，3’端修饰有淬灭基团。 6.如权利要求5所述的三重荧光定量RT-qPCR检测试剂盒，其中，所述报告基团选自但不限于FAM、HEX、JOE、CY3、CY5、ROX，所述淬灭基团选自但不限于DABCYL、TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3。 7.如权利要求6所述的三重荧光定量RT-qPCR检测试剂盒，其中，用于检测PEDV的探针的报告基团为FAM，淬灭基团为BHQ1；用于检测PDCoV的探针的报告基团为CY5，淬灭基团为BHQ3；用于检测RV-A的探针的报告基团为ROX，淬灭基团为BHQ2。 8.如权利要求1所述的三重荧光定量RT-qPCR检测试剂盒，其中，所述试剂盒还包括酶反应液、腹泻三重PCR反应液、腹泻三重阳性对照、腹泻三重阴性对照。 9.如权利要求8所述的三重荧光定量RT-qPCR检测试剂盒，其中，所述的腹泻三重阳性对照为带有PEDVN基因、PDCoVM基因和RV-ANSP5基因片段的阳性重组质粒标准品模板。