LIGHT蛋白作为采用细胞毒性法检测IFN-γ生物活性的辅助试剂的应用
本发明公开了LIGHT蛋白作为采用细胞毒性法检测IFN‑γ生物活性的辅助试剂的应用。还公开了联用LIGHT蛋白检测IFN‑γ生物活性的方法，以及相应的检测试剂盒。本发明建立了一种针对IFN‑γ的细胞毒生物活性的生物活性检测方法，通过IFN‑γ与LIGHT蛋白的联合使用来增强细胞毒性，提高了检测过程中HT‑29细胞对IFN‑γ细胞毒性的敏感度，显著提高了检测结果的准确性和灵敏度，缩短了检测时间，改善了其重现性。该方法快速，高效，可重复性高，成本较低，易推广，适合高通量作业，能够满足IFN‑γ的生产及研发过程中，对IFN‑γ的筛选、产品放行以及稳定性评价的需要。
发明专利
CN202310888357.7
2023-07-19
CN117448413A
2024-01-26
C12Q1/02(2006.01)
翌圣生物科技(上海)股份有限公司
易红飞;孙祥祥
200120 上海市浦东新区天雄路166弄1号楼402室
苏州根号专利代理事务所(普通合伙)
朱华庆
上海;31
1.LIGHT蛋白作为采用细胞毒性法检测IFN-γ生物活性的辅助试剂的应用。 2.一种联用LIGHT蛋白检测IFN-γ生物活性的方法，其特征在于其步骤包括： (1)试剂准备：取培养基、FBS和LIGHT蛋白，配置成含FBS和LIGHT蛋白的样品稀释液，取参考品和供试品IFN-γ蛋白，用所述的样品稀释液分别进行稀释； (2)取处在对数生长期的细胞经消化后的悬液，计数并计算细胞悬液中的细胞密度及活率，然后铺板； (3)将稀释好的参考品及供试品分别加入铺好细胞的细胞培养板中，进行细胞培养； (4)采用活细胞定量检测或者死细胞定量检测方法，获得供试品EC50值以及参考品EC50值，通过如下公式计算供试品的生物活性： 供试品生物活性＝(供试品EC50值×参考品生物活性/参考品EC50值)； 其中参考品为已知生物活性的IFN-γ蛋白。 3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤(1)中培养基为McCoy's 5A培养基，样品稀释液中含5ng/mL-20ng/mL LIGHT。 4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤(1)中培养基为McCoy's 5A培养基，样品稀释液中含2％-10％体积比的FBS。 5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤(1)中参考品和供试品的稀释浓度为0.006～400ng/mL。 6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤(2)中将细胞悬液中的细胞浓度调整到2.0～3.0×104个/mL后再铺板。 7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于在步骤(2)完成铺板后，将稀释好的参考品及供试品分别加入细胞呈现悬浮状态的细胞培养板中。 8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤(3)中还设有空白孔，仅加入添加参考品或供试品的样品稀释液，不加入细胞。 9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于步骤(4)具体为在细胞培养板的孔中加入CCK-8，完成后将细胞培养板继续孵育一段时间；将细胞培养板放入酶标仪，并将空白孔设置为组空白，读取供试品孔和参考品孔分别扣除组空白后的OD450的值，用参考品孔和供试品孔的OD450值与加药浓度的量效关系进行四参数拟合，确定供试品和参考品的EC50值。 10.一种联用LIGHT蛋白检测IFN-γ生物活性的试剂盒，其特征在于包括LIGHT蛋白、已知生物活性的IFN-γ蛋白参考品、培养基、FBS、CCK-8以及HT-29细胞。