NtWAKL1基因及其在培育高抗镰刀菌植物中的应用

摘要：

本发明属于烟草遗传育种领域，涉及高抗镰刀菌植物的培育，特别是指一种NtWAKL1基因在培育高抗镰刀菌植物中的应用。根据NtWAKL1基因的核苷酸序列筛选基因编辑靶位点的sgRNA序列，并设计sgRNA引物对；通过退火反应获得靶位点的序列，经酶切、连接获得NtWAKL1‑‑pORE‑Cas9载体；NtWAKL1‑pORE‑Cas9载体经农杆菌GV3101介导的遗传转化获得基因编辑株系。经分析，该基因在响应镰刀菌入侵中起到识别细胞壁多糖降解产物作为入侵信号、调控植物与病原互作基因的表达的作用。通过基因编辑敲除该基因、沉默其功能，可以实现提高感病株系对镰刀菌抗性。

专利类型：发明专利

申请/专利号：CN202310874784.X

申请日期：2023-07-17

公开/公告号：CN117646021A

公开/公告日：2024-03-05

主分类号：C12N15/82(2006.01)

申请/专利权人:河南省农业科学院烟草研究所

发明/设计人:平文丽;李雪君;孙计平;孙焕;刘伟龙;李丽华;俎焕新;李旭辉;侯咏;张雪珂

主申请人地址:461000 河南省许昌市魏都区高桥营乡俎庄

专利代理机构:郑州优盾知识产权代理有限公司

代理人:冉珊敏

国别省市代码:河南;41

权利要求：

1.NtWAKL1基因在培育高抗镰刀菌植物中的应用。 2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述NtWAKL1基因编码的蛋白的序列与SEQ ID No.2所示的氨基酸序列存在90%以上的相似度。 3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述蛋白的结构包含依次相连的一个信号肽，一个WAK结合域，一个跨膜区以及一个蛋白激酶结构域。 4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述NtWAKL1基因的核苷酸序列与SEQ IDNo.1所示的核苷酸序列存在90%以上的相似度。 5.根据权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于：所述植物为烟草。 6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤为： （1）根据NtWAKL1基因的核苷酸序列筛选基因编辑靶位点的sgRNA序列，并设计sgRNA引物对； （2）通过退火反应获得靶位点的序列，经酶切、连接将靶位点的序列插入CRISPR/Cas9载体pORE-Cas9，获得NtWAKL1-pORE-Cas9载体； （3）NtWAKL1-pORE-Cas9载体经农杆菌GV3101介导的转化转化获得基因编辑株系，即高抗镰刀菌植物。 7. 根据权利要求6所示的应用，其特征在于：所述步骤（1）中sgRNA序列如SEQ ID No.3所示。 8. 根据权利要求7所示的应用，其特征在于：所述sgRNA引物对序列如SEQ ID No.3所示和SEQ ID No.4所示。 9. 根据权利要求6-8任一项所示的应用，其特征在于，所述步骤（2）中退火反应的体系为：Annealing buffer for DNA Oligos （5×）4 μL；上下游引物各用4 μL；Nuclease-free水，12 μL。 10. 根据权利要求8所示的应用，其特征在于，所述反应程序为：95℃ 5min，每8s下降0.1 ℃，直至温度降至25℃。