2-酮戊二酸依赖性双加氧酶及其应用
本发明涉及一种2‑酮戊二酸依赖性双加氧酶及其应用。本发明的多肽与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:21的多肽具有至少60％，至少65％，至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列相似性。实验证明，本发明的多肽具有2‑酮戊二酸依赖性双加氧酶的功能，能够催化洋川芎内酯A生成丁苯酞。本发明对有效解决丁苯酞资源稀缺问题具有重要意义。
发明专利
CN202310719497.1
2023-06-16
CN116536280A
2023-08-04
C12N9/02(2006.01)
中国农业科学院深圳农业基因组研究所
王丽;陈雪青;侯壮伟;孙文恺;聂宝;李诚
518124 广东省深圳市大鹏新区鹏飞路7号
北京锺维联合知识产权代理有限公司
陈晓庆
广东;44
1.一种多肽，为如下任一所述多肽： (1)氨基酸序列包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:21的多肽； (2)氨基酸序列与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:17或SEQID NO:19或SEQ ID NO:21具有至少10％或至少12％或至少14％或至少15％或至少16％或至少17％或至少18％或至少19％或至少20％或至少21％或至少22％或至少24％或至少26％或至少28％或至少29％或至少30％或至少31％或至少32％或至少34％或至少36％或至少38％或至少40％或至少42％或至少44％或至少46％或至少48％或至少50％或至少52％或至少54％或至少56％或至少58％或至少59％或至少60％或至少65％或至少70％或至少75％或至少80％或至少81％或至少82％或少83％或至少84％或至少85％或至少86％或至少87％或至少88％或至少89％或至少90％或至少91％或至少92％或至少93％或至少94％或至少95％或至少96％或至少97％或至少98％或至少99％以上相似性的多肽，且该多肽具有2-酮戊二酸依赖性双加氧酶活性或该多肽是2-酮戊二酸依赖性双加氧酶家族的成员； (3)氨基酸序列与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:17或SEQID NO:19或SEQ ID NO:21具有至少10％或至少12％或至少14％或至少15％或至少16％或至少17％或至少18％或至少19％或至少20％或至少21％或至少22％或至少24％或至少26％或至少28％或至少29％或至少30％或至少31％或至少32％或至少34％或至少36％或至少38％或至少40％或至少42％或至少44％或至少46％或至少48％或至少50％或至少52％或至少54％或至少56％或至少58％或至少59％或至少60％或至少65％或至少70％或至少75％或至少80％或至少81％或至少82％或少83％或至少84％或至少85％或至少86％或至少87％或至少88％或至少89％或至少90％或至少91％或至少92％或至少93％或至少94％或至少95％或至少96％或至少97％或至少98％或至少99％以上相似性的多肽，且该多肽来源于川芎(Ligusticum chuanxiong hort.)，且该多肽具有2-酮戊二酸依赖性双加氧酶活性或该多肽是2-酮戊二酸依赖性双加氧酶家族的成员； (4)由如下多核苷酸编码得到的多肽：(a)SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14或SEQID NO:16或SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:20所示的多核苷酸；(b)核酸序列与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12或SEQ IDNO:13或SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:20具有60％以上相似性的多核苷酸；(c)在严格条件下与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:9或SEQ IDNO:10或SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:20所示多核苷酸或其互补序列或其gDNA杂交的多核苷酸，该多肽具有2-酮戊二酸依赖性双加氧酶活性或该多肽是2-酮戊二酸依赖性双加氧酶家族的成员； (5)在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:21的基础上进行一个位置或多个位置的氨基酸残基替换、插入和/或缺失后得到的多肽突变体，该多肽突变体具有2-酮戊二酸依赖性双加氧酶活性或该多肽突变体是2-酮戊二酸依赖性双加氧酶家族的成员； (6)在SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的基础上，在如下任意一个位置或任意几个位置进行氨基酸残基替换、插入和/或缺失后得到的多肽突变体：自其N端起第180位氨基酸、第102位氨基酸、第76位氨基酸、第165位氨基酸、第66位氨基酸，该多肽突变体具有2-酮戊二酸依赖性双加氧酶活性或该多肽突变体是2-酮戊二酸依赖性双加氧酶家族的成员； (7)在SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:21所示氨基酸序列的基础上，在如下任意一个位置或任意几个位置进行氨基酸残基替换、插入和/或缺失后得到的多肽突变体：与自SEQ ID NO:1的N端起第180位氨基酸、第102位氨基酸、第76位氨基酸、第165位氨基酸、第66位氨基酸对应的位置；该多肽突变体具有2-酮戊二酸依赖性双加氧酶活性或该多肽突变体是2-酮戊二酸依赖性双加氧酶家族的成员； (8)在SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的基础上，进行如下任意一种或任意几种的突变后得到的多肽突变体：W180A、Y102A、Y76F、G165A、Q66A；该多肽突变体具有2-酮戊二酸依赖性双加氧酶活性或该多肽突变体是2-酮戊二酸依赖性双加氧酶家族的成员； (9)在SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:21所示氨基酸序列的基础上，以SEQ ID NO:1为参照，在相对应的位置上进行任一种或任几种相应的氨基酸种类突变后得到的多肽突变体；其中，SEQ ID NO:1中相应位置和相应氨基酸突变种类为如下的任一种或任几种：W180A、Y102A、Y76F、G165A、Q66A；该多肽突变体具有2-酮戊二酸依赖性双加氧酶活性或该多肽突变体是2-酮戊二酸依赖性双加氧酶家族的成员； (10)在(1)或(2)或(3)或(4)或(5)或(6)或(7)或(8)或(9)所示多肽的N-末端或C-末端处融合另一多肽后形成的融合多肽。 2.编码权利要求1所述多肽的多核苷酸。 3.根据权利要求2所述的多核苷酸，其特征在于：所述多核苷酸为如下(1)或(2)或(3)： (1)包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:18或SEQID NO:20的多核苷酸； (2)核酸序列与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10或SEQ IDNO:11或SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:20具有至少60％或至少65％或至少70％或至少75％或至少80％或至少81％或至少82％或少83％或至少84％或至少85％或至少86％或至少87％或至少88％或至少89％或至少90％或至少91％或至少92％或至少93％或至少94％或至少95％或至少96％或至少97％或至少98％或至少99％以上序列相似性的多核苷酸，且该多核苷酸编码的多肽具有2-酮戊二酸依赖性双加氧酶活性或是2-酮戊二酸依赖性双加氧酶家族的成员； (3)在严格条件下与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10或SEQID NO:11或SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:20所示多核苷酸或其互补体或其gDNA杂交的多核苷酸，且该多核苷酸编码的多肽具有2-酮戊二酸依赖性双加氧酶活性或是2-酮戊二酸依赖性双加氧酶家族的成员。 4.含有权利要求2或3所述多核苷酸的重组载体、核酸构建体或重组宿主细胞。 5.一种蛋白提取物，是川芎(Ligusticum chuanxiong Hort.)根的总蛋白提取物，该提取物具有2-酮戊二酸依赖性双加氧酶活性或该提取物中含有2-酮戊二酸依赖性双加氧酶家族的成员酶。 6.一种制备苯酞类化合物的方法，包括如下步骤：以式Ⅰ和/或式Ⅱ所示化合物为底物，使其与酶接触，得到式Ⅲ和/或式Ⅳ所示苯酞类化合物，其中酶是2-酮戊二酸依赖性双加氧酶家族中的酶或该酶具有2-酮戊二酸依赖性双加氧酶活性； 其中，式Ⅰ，式Ⅱ，式Ⅲ或式Ⅳ中R为不含任何取代基的碳原子数为1～10的直链烷烃，其中碳原子数为1-2，1-3，1-4，1-5，1-6，1-7，1-8，1-9，1-10，2-3，2-4，2-5，2-6，2-7，2-8，2-9，2-10，3-4，3-5，3-6，3-7，3-8，3-9，3-10，4-5，4-6，4-7，4-8，4-9，或4-10，或具体为1，2，3，4，5，6，7，8，9，10。 7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述酶为权利要求1中所述多肽的任意一种或几种，或者为权利要求5所述蛋白提取物。 8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述式Ⅱ所示化合物为洋川芎内酯A，所述式Ⅰ所示化合物为藁本内酯。 9.根据权利要求6-8任意所述的方法，其特征在于：所述式Ⅳ所示化合物为丁苯酞，所述式Ⅲ所示化合物为丁烯基苯酞。 10.制备权利要求1所述多肽的方法，包括如下步骤：在有利于多肽表达的条件下，使含有权利要求2所述多核苷酸的重组宿主细胞进行表达，得到权利要求1所述多肽。