NK细胞的制备和转染方法
本发明涉及NK细胞的制备和转染方法，具体提供一种制备NK细胞的方法，包括：1)从源自脐带血的细胞样品分离CD3‑细胞，2)使用活化培养基培养所述CD3‑细胞，获得第一细胞群，和3)使用第一扩增培养基培养所述第一细胞群，获得含NK细胞的第二细胞群。本发明还提供一种制备转染的NK细胞的方法，包括：a)转染由本文所述方法获得的NK细胞，和b)使用转染后培养基培养转染的细胞，所述转染后培养基包含基础培养基、血清、IL2、IL15。根据本发明方法的NK的扩增和转染的具有极高的可重复性，稳定性好。
发明专利
CN202310081129.9
2023-01-16
CN118360244A
2024-07-18
C12N5/0783(2010.01)
中国科学院分子细胞科学卓越创新中心
刘小龙;李心悦
200031 上海市徐汇区岳阳路320号35号楼
上海专利商标事务所有限公司
韦东
上海;31
1.一种制备NK细胞的方法，所述方法包括： 1)从源自脐带血的细胞样品分离CD3-细胞； 2)使用活化培养基培养所述CD3-细胞，获得第一细胞群；和 3)使用第一扩增培养基培养所述第一细胞群，获得含NK细胞的第二细胞群；和 任选的4)使用第二扩增培养基培养所述第二细胞群，获得含NK细胞的第三细胞群； 所述活化培养基包含基础培养基、血清、IL2、IL15、肝素钠或肝素锂、zoledronate、谷氨酰胺； 所述第一扩增培养基包含基础培养基、血清、IL2、IL15； 所述第二扩增培养基包含基础培养基、血清、IL2、IL15； 优选地： 所述活化培养基包含1％-5％血清、100～500U/mL IL2、30～200U/mL IL15、4～10U/mL肝素钠或肝素锂，2-15uM zoledronate或其水合物和10-1000uM谷氨酰胺；更优选地，所述活化培养基包含2％-4％血清、200～400U/mL IL2、50～100U/mL IL15、6～8U/mL肝素钠或肝素锂，5-10uM zoledronate或其水合物和100-500uM谷氨酰胺，和/或 所述第一扩增培养基包含3-15％血清、100-1000U/mL IL2和10-1000U/mL IL15；更优选地，所述第一扩增培养基包含5％-10％血清、200-500U/mL IL2和50-400U/mL IL15，和/或 所述第二扩增培养基包含5-20％血清、500-3000U/mL IL2和100-1500U/mL IL15；更优选地，所述第二扩增培养基包含8-15％血清、1000～2000U/mL IL2和400～800U/mL IL15。 2.如权利要求1所述的方法，其特征在于： 步骤1)包括：1.1)使用含EDTA的磷酸盐缓冲液以1:2-1:5(v/v)稀释脐带血，1.2)使用Ficoll密度梯度离心法获取脐带血单核细胞，任选的1.3)冻存和解冻细胞，和1.4)使用CD3结合剂分离CD3+和CD3-细胞；和/或 步骤2)包括：以0.5E6/ml至2E6/ml的细胞浓度使用所述活化培养基培养CD3-细胞，获得第一细胞群；和/或 步骤3)包括：以0.5E6/ml至2E6/ml的细胞浓度使用所述第一扩增培养基培养所述第一细胞群，获得第二细胞群；和/或 步骤4)包括：以0.5E6/ml至2E6/ml的细胞浓度使用所述第二扩增培养基培养所述第二细胞群，获得NK细胞。 3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述方法还包括选自以下的一项或多项特征： 步骤1.1)中的磷酸盐缓冲液是含2mM的EDTA的PBS，优选0-4℃； 所述CD3结合剂是偶联有可选择标记物的CD3抗体，优选地所述可选择标记物优选是固相载体； 步骤1.3)包括步骤，i)使用预冷的冻存液重悬脐带血单核细胞，梯度降温至-80℃，和ii)37-39℃水浴融化细胞，重悬至培养基中，然后收集细胞重悬至PBS中； 所述第二细胞群的至少90％为NK细胞； 所述第三细胞群的至少90％为NK细胞； 所述NK细胞是CD56+CD3-NK细胞。 4.权利要求1-3中任一项所述方法获得的表型为CD56+CD3-的NK细胞的悬液，其中扩增的细胞群的至少90％为NK细胞。 5.权利要求1-3中任一项所述方法获得的表型为CD56+CD3-的NK细胞在制备预防和/或治疗癌症的药物中的用途。 6.一种制备转染的NK细胞的方法，所述方法包括： a)转染由权利要求1-3中任一项所述方法获得的NK细胞；和 b)使用转染后培养基培养转染的细胞，所述转染后培养基包含基础培养基、血清、IL2、IL15； 优选地，所述转染后培养基包含5-20％血清、500-3000U/mL IL2和50-1500U/mL IL15；更优选地，所述第二扩增培养基包含8-15％血清、1000～2000U/mL IL2和100～800U/mLIL15； 优选地，所述转染是电转。 7.如权利要求6所述的方法，其特征在于： 步骤a)包括：a.1)使用PBS清洗和重悬所述NK细胞，和a.2)以0.5E620ul至2E6/20ul的NK细胞浓度和0.2-10ug/20ul的mRNA浓度在转染试剂中使用电转程序进行电转；和/或 步骤b)包括：在电转结束后1-5分钟内补加50-100uL的预热的转染后培养基，所述培养包括37度培养至少3分钟；和/或 所述方法还包括步骤c)：在预热的培养基中培养细胞至少3小时；和/或 所述方法在步骤a)之前还包含权利要求1-3中任一项所述方法的步骤。 8.如权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述方法还包括选自以下一项或多项特征： 步骤a.1)中的PBS的温度为4-25度，优选4度； 所述NK细胞是从权利要求1-3中任一项所述方法的步骤2)开始的培养第7天或之后收获的NK细胞； 转染试剂包含体积比为20:1～20:10的电转溶剂与水或柠檬酸钠，优选地，所述柠檬酸钠的浓度为0.1-10Mm。 9.一种药物组合物，其包含由权利要求1-3中任一项所述方法获得的NK细胞或权利要求6-8中任一项获得的转染的NK细胞，和药学上可接受的辅料。 10.一种试剂盒，其包含活化培养基、第一扩增培养基和第二扩增培养基，任选还包含转染后培养基； 所述活化培养基包含基础培养基、血清、IL2、IL15、肝素钠或肝素锂、zoledronate和谷氨酰胺，所述第一扩增培养基包含基础培养基、血清、IL2和IL15，所述第二扩增培养基包含基础培养基、血清、IL2和IL15，所述转染后培养基包含基础培养基、血清、IL2和IL15； 优选地： 所述活化培养基包含1％-5％血清、100～500U/mL IL2、30～200U/mL IL15、4～10U/mL肝素钠或肝素锂，2-15uM zoledronate或其水合物和10-1000uM谷氨酰胺；更优选地，所述活化培养基包含2％-4％血清、200～400U/mL IL2、50～100U/mL IL15、6～8U/mL肝素钠或肝素锂，5-10uM zoledronate或其水合物和100-500uM谷氨酰胺； 所述第一扩增培养基包含3-15％血清、100-1000U/mL IL2和10-1000U/mL IL15；更优选地，所述第一扩增培养基包含5％-10％血清、200-500U/mL IL2和50-400U/mL IL15； 所述第二扩增培养基包含5-20％血清、500-3000U/mL IL2和100-1500U/mL IL15；更优选地，所述第二扩增培养基包含8-15％血清、1000～2000U/mL IL2和400～800U/mL IL15； 所述转染后培养基包含5-20％血清、500-3000U/mL IL2和50-1500U/mL IL15；更优选地，所述第二扩增培养基包含8-15％血清、1000～2000U/mL IL2和100～800U/mL IL15。