LICKs在改造植物共生细胞信号通路中的应用
本发明属于生物技术和植物学领域；涉及植物细胞信号通路改造，通过调节植物共生和免疫信号的方法，特别是基于LICKs构成的植物体内新机制在改造植物共生和免疫信号通路潜能中的应用。本发明还提供了植物信号通路改造实现共生固氮的新靶点，从而为植物的改造提供了可行的方法，为植物的分子育种提供了新的方向。
发明专利
CN202310074287.1
2023-01-17
CN118360313A
2024-07-18
C12N15/82(2006.01)
中国科学院分子植物科学卓越创新中心
王二涛;王大鹏;金蕊;石小保;杨军
200032 上海市徐汇区枫林路300号
上海专利商标事务所有限公司
陈静
上海;31
1.一种调节根瘤植物或根瘤共生植物的根瘤共生或免疫能力的方法，包括：调节所述植物中LICKs的表达或活性；或调节所述植物中含有LICKs的NFP-LYK3-LICKs-DMI2信号通路或LICKs-RBOHs-ROS信号通路；其中，所述LICKs包括LICK1和/或LICK2，所述RBOHs包括RBOHB。 2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述调节所述植物的根瘤共生或免疫能力包括： (a)上调LICKs的表达或活性，或上调NFP-LYK3-LICKs-DMI2信号通路，从而促进植物与根瘤菌的共生、增强结瘤因子受体的活性； (b)下调LICKs的表达或活性，或下调LICKs-RBOHs-ROS信号通路，从而提高植物的免疫能力。 3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述上调LICKs的表达或活性包括：促进LICKs的磷酸化；将LICKs的编码基因或含有该编码基因的表达构建物或载体转入所述植物中；对LICKs进行功能获得性突变；以表达增强型启动子或组织特异性启动子促进LICKs表达；或，以增强子促进LICKs表达；或 所述下调LICKs的表达或活性包括：在所述植物中敲除或沉默LICKs的编码基因，或抑制LICKs的活性；较佳地，包括：以特异性干扰LICKs的编码基因表达的干扰分子来沉默LICKs，以CRISPR系统进行基因编辑从而敲除LICKs的编码基因，以同源重组的方法敲除LICKs编码基因，在含有LICKs的植物中将LICKs进行功能下调或丧失性突变，或抑制LICKs的磷酸化，或改变启动子区域以降低LICKs的表达水平。 4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述上调NFP-LYK3-LICKs-DMI2信号通路包括：上调LICKs的表达或活性、促进LYK3-LICKs相互作用，从而激活LYK3、促进LYK3与DMI2相互作用，促进根瘤共生；较佳地，所述LYK3-LICKs相互作用包括：形成复合体、发生LYK3及LICKs的磷酸化；较佳地，所述LYK3与DMI2相互作用包括：形成复合体、LYK3促进DMI2的磷酸化；或 所述下调LICKs-RBOHs-ROS信号通路包括：下调LICKs的表达或活性，弱化LICKs-RBOHs相互作用或减少LICKs-RBOHs复合体，从而促进ROS积累，提高植物的免疫能力。 5.一种LICKs、含有LICKs的NFP-LYK3-LICKs-DMI2信号通路或LICKs-RBOHs-ROS信号通路或它们的调节剂的用途，用于调节根瘤植物或根瘤共生植物的根瘤共生或免疫能力；所述的调节剂包括上调剂或下调剂；所述LICKs包括LICK1和/或LICK2，所述RBOHs包括RBOHB。 6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述LICKs的上调剂用于促进所述植物与根瘤菌的共生、增强结瘤因子受体的活性，包括：LICKs磷酸化试剂，较佳地为将LICKs进行磷酸化突变的试剂；外源的LICKs编码基因或含有该编码基因的表达构建物或载体；或，对LICKs进行功能获得性点突变的试剂，较佳地为在发生LICKs突变的植物中将突变体回复为LICKs野生型的试剂；或 所述的LICKs下调剂用于提高所述植物的免疫能力，包括：敲除或沉默LICKs的试剂，抑制LICKs活性的试剂；较佳地，包括：特异性干扰LICKs的编码基因表达的干扰分子，针对LICKs的CRISPR基因编辑试剂、同源重组试剂或定点突变试剂，所述试剂将LICKs进行功能下调或丧失性突变或进行去磷酸化，或改变LICKs启动子区域降低其表达水平的试剂。 7.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述的NFP-LYK3-LICKs-DMI2信号通路的上调剂用于促进所述植物与根瘤菌的共生、增强结瘤因子受体的活性，包括：LICKs上调剂，LICKs磷酸化试剂；或 所述的LICKs-RBOHs-ROS信号通路的下调剂用于促进ROS积累，提高植物的免疫能力，包括：LICKs下调剂。 8.一种鉴定根瘤植物或根瘤共生植物的根瘤共生性状的方法，包括：分析植物的LICKs基因的表达水平、LICKs蛋白积累水平和/或磷酸化修饰水平；若LICKs基因的表达水平，LICKs蛋白质积累水平和/或磷酸化修饰水平正常，则植物根瘤共生性状正常；若LICKs基因的表达水平，LICKs蛋白积累水平或磷酸化修饰水平异常，则植物根瘤共生性状异常； 其中，所述植物根瘤共生性状包括：根部响应根瘤菌侵染的能力，根部响应结瘤因子信号的能力，侵染线形成，上调根瘤共生标记基因表达的能力，根瘤形成。 9.一种筛选调节根瘤植物或根瘤共生植物的根瘤共生或免疫能力的物质(潜在物质)的方法，包括： (1)将候选物质加入到表达LICKs的体系中； (2)检测所述体系，观测其中LICKs的表达或活性，若其表达或活性提高，则表明该候选物质为可用于促进植物与根瘤菌的共生、增强结瘤因子受体的活性的物质；若其表达或活性降低，则表明该候选物质为可用于提高植物的免疫能力的物质； 较佳地，所述观测其中LICKs的活性包括观测LICKs的磷酸化水平，若磷酸化水平显著提高，则表明该候选物质为可用于促进植物与根瘤菌的共生、增强结瘤因子受体的活性的物质。 10.一种筛选调节根瘤植物或根瘤共生植物的根瘤共生的物质的方法，包括： (1)将候选物质加入到表达NFP-LYK3-LICKs-DMI2信号通路的体系中； (2)检测所述体系，观测NFP-LYK3-LICKs-DMI2信号通路蛋白的表达、活性或磷酸化水平，若其表达、活性或磷酸化水平提高，则表明该候选物质为可用于促进植物与根瘤菌的共生、增强结瘤因子受体的活性的物质。 11.一种筛选调节根瘤植物或根瘤共生植物的免疫能力的物质的方法，包括： (1)将候选物质加入到表达LICKs-RBOHs-ROS信号通路的体系中； (2)检测所述体系，观测LICKs-RBOHs-ROS信号通路蛋白的表达或活性，若其表达或活性降低，则表明该候选物质为可用于提高植物的免疫能力的物质。 12.一种根瘤植物LICKs或包含其的NFP-LYK3-LICKs-DMI2信号通路或LICKs-RBOHs-ROS信号通路的用途，用于作为鉴定根瘤植物的根瘤共生或免疫能力的分子标记。 13.如权利要求1-12任一所述的方法或用途，其特征在于，所述根瘤共生的性状包括根部响应根瘤菌侵染的能力，根部响应结瘤因子信号的能力，侵染线形成，上调根瘤共生标记基因表达的能力，根瘤形成；或 所述免疫能力包括植物抵抗病原体的能力；较佳地，所述病原体是昆虫、真菌、细菌、病毒、线虫、类病毒、支原体，更优选所述病原体是青枯病菌。 14.如权利要求1-12任一所述的方法或用途，其特征在于，所述的根瘤植物或根瘤共生植物包括选自下组： 表达LICKs、含有LICKs的NFP-LYK3-LICKs-DMI2信号通路或LICKs-RBOHs-ROS信号通路的植物； 豆科植物，禾本科植物，葡萄，烟草或杨树；较佳地，所述豆科植物包括：苜蓿、大豆、百脉根、豌豆、鹰嘴豆、羽扇豆、菜豆、车轴草、山麻黄；较佳地，所述禾本科植物包括：水稻、大麦、小麦、燕麦、黑麦、玉米或高粱。 15.如权利要求1-12任一所述的方法或用途，其特征在于，LICK1蛋白包括选自下组：(a1)如SEQ ID NO:3氨基酸序列的蛋白；(b1)将SEQ ID NO:3氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a1)蛋白功能的由(a1)衍生的蛋白；(c1)与(a1)限定的蛋白序列有80％以上同源性且具有(a1)蛋白功能的由(a1)衍生的蛋白；或(d1)(a1)限定的蛋白活性片段，或其两端添加标签序列、酶切序列、报告蛋白后形成的蛋白；和/或 LICK2蛋白包括选自下组：(a2)如SEQ ID NO:4氨基酸序列的蛋白；(b2)将SEQ ID NO:4氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a2)蛋白功能的由(a2)衍生的蛋白；(c2)与(a2)限定的蛋白序列有80％以上同源性且具有(a2)蛋白功能的由(a2)衍生的蛋白；或(d2)(a2)限定的蛋白活性片段，或其两端添加标签序列、酶切序列、报告蛋白后形成的蛋白。 16.如权利要求15所述的方法或用途，其特征在于，所述的LICKs蛋白为LICK1蛋白变体或LICK2蛋白变体；所述的突变位点是所述LICK1蛋白或所述LICK2蛋白的磷酸化位点；较佳地，所述的LICK1蛋白变体包括在如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列中的K78、S149、S203、Y346、S60、T206、T207、S292、Y160、T183、T151、T44、S11、T36、T212、S177、S361中一个或多个氨基酸的替换、删除、增加或突变；和/或所述的LICK2蛋白变体包括在如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列中的K73、T264、T201、S55、T18、S198、T254、S198、T288、T324、S330中一个或多个氨基酸的替换、删除、增加或突变；较佳地，所述LICK1蛋白变体包括：S60A、S60D、S203A、S203D、T206A、T206D和/或K78E；所述LICK2蛋白变体包括：S55A、S55D、S198A、S198D、T201A、T201D和/或K73E； 更佳地，所述的LICK1蛋白变体是SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列中第60位、第203位、第206位氨基酸突变为D的变体；所述的LICK2蛋白变体是SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列中第55位，第198位和第201位氨基酸突变为D的变体。