RNA构建体及其用途
本文公开了包含5'帽、包含本文公开的帽近端序列的5'UTR和编码有效负载的序列的RNA多核苷酸。本文还公开了包含所述RNA多核苷酸的组合物和医药制剂，以及制备和使用所述RNA多核苷酸的组合物和方法。
发明专利
CN202280083921.1
2022-10-27
CN118414429A
2024-07-29
C12N15/67(2006.01)
生物技术欧洲股份公司
G·博罗斯;K·卡里科
德国美因兹
永新专利商标代理有限公司
王健%林晓红
德国;DE
1.一种包含RNA多核苷酸的组合物或医药制剂，所述RNA多核苷酸包含： 5'帽；包含所述RNA多核苷酸的位置+1、+2、+3、+4和+5的帽近端序列；以及编码有效负载的序列，其中： (i)所述5'帽是包含N1pN2的三核苷酸帽结构，其中N1是所述RNA多核苷酸的位置+1，并且N2是所述RNA多核苷酸的位置+2，并且其中N1是A并且N2是U；并且 (ii)所述帽近端序列包含： 所述三核苷酸帽结构的N1和N2以及包含分别在所述RNA多核苷酸的位置+3、+4和+5处的N3N4N5的序列，其中N3是A，并且N4和N5各自选自：A、C、G和U。 2.一种包含RNA多核苷酸的组合物或医药制剂，所述RNA多核苷酸包含： 5'帽；包含所述RNA多核苷酸的位置+1、+2、+3、+4和+5的帽近端序列；以及编码有效负载的序列，其中： (i)所述5'帽是包含N1pN2的三核苷酸帽结构，其中N1是所述RNA多核苷酸的位置+1，并且N2是所述RNA多核苷酸的位置+2，并且其中N1和N2选自以下组合之一：(a)N1是G并且N2是G；(b)N1是U并且N2是G；(c)N1是A并且N2是G；或(d)N1是C并且N2是G；并且 (ii)所述帽近端序列包含： 所述三核苷酸帽结构的N1和N2以及包含分别在所述RNA多核苷酸的位置+3、+4和+5处的N3N4N5的序列，其中N3是C，N4是G，并且N5选自：A、C、G和U。 3.一种包含RNA多核苷酸的组合物或医药制剂，所述RNA多核苷酸包含： 5'帽；包含所述RNA多核苷酸的位置+1、+2、+3、+4和+5的帽近端序列；以及编码有效负载的序列，其中： (i)所述5'帽是包含N1pN2的三核苷酸帽结构，其中N1是所述RNA多核苷酸的位置+1，并且N2是所述RNA多核苷酸的位置+2，并且其中N1是G并且N2是C；并且 (ii)所述帽近端序列包含： 所述三核苷酸帽结构的N1和N2以及包含分别在所述RNA多核苷酸的位置+3、+4和+5处的N3N4N5的序列，其中N3是G，并且N4和N5各自选自：A、C、G和U。 4.如权利要求1-3中任一项所述的组合物或医药制剂，其中所述三核苷酸帽结构具有结构：G*N1pN2，其中 G*包含式(I)的结构： 或其盐， 其中 R2和R3各自是-OH或-OCH3；并且 X是O或S。 5.如权利要求4所述的组合物或医药制剂，其中R2是-OH。 6.如权利要求4所述的组合物或医药制剂，其中R2是-OCH3。 7.如权利要求4-6中任一项所述的组合物或医药制剂，其中R3是-OH。 8.如权利要求4-7中任一项所述的组合物或医药制剂，其中R3是-OCH3。 9.如权利要求4-8中任一项所述的组合物或医药制剂，其中X是O。 10.如权利要求1-9中任一项所述的组合物或医药制剂，其中所述三核苷酸帽结构包括Cap0或Cap1结构。 11.如权利要求1-9中任一项所述的组合物或医药制剂，其中所述三核苷酸帽结构包括(m2’-O)N1pN2。 12.如权利要求1所述的组合物或医药制剂，其中所述三核苷酸帽结构是(m7)Gppp(m2’-O)ApU。 13.如权利要求2或3所述的组合物或医药制剂，其中所述三核苷酸帽结构选自由以下组成的组：(m27,3’-O)Gppp(m2’-O)ApG(“CleanCap AG”、“CC413”)、(m27,3’-O)Gppp(m2’-O)GpG(“CleanCap GG”)、(m7)Gppp(m2’-O)ApG和(m27,3’-O)Gppp(m26,2’-O)ApG。 14.一种包含RNA多核苷酸的组合物或医药制剂，所述RNA多核苷酸包含： 5'帽；包含所述RNA多核苷酸的位置+1、+2、+3、+4和+5的帽近端序列；以及编码有效负载的序列，其中： (i)所述5'帽是包含N1的二核苷酸帽结构，其中N1是所述RNA多核苷酸的位置+1，并且其中N1是G；并且 (ii)所述帽近端序列包含： 所述二核苷酸帽结构的N1以及包含分别在所述RNA多核苷酸的位置+2、+3、+4和+5处的N2N3N4N5的序列，其中N2是C，N3是G，并且N4和N5各自选自：A、C、G和U。 15.如权利要求14所述的组合物或医药制剂，其中所述二核苷酸帽结构是：G*N1，其中 G*包含式(I)的结构： 或其盐， 其中 R2和R3各自是-OH或-OCH3；并且 X是O或S。 16.如权利要求14所述的组合物或医药制剂，其中R2是-OH。 17.如权利要求14所述的组合物或医药制剂，其中R2是-OCH3。 18.如权利要求14-16中任一项所述的组合物或医药制剂，其中R3是-OH。 19.如权利要求14-16中任一项所述的组合物或医药制剂，其中R3是-OCH3。 20.如权利要求14-18中任一项所述的组合物或医药制剂，其中X是O。 21.如权利要求14-18中任一项所述的组合物或医药制剂，其中X是S。 22.如权利要求14-20中任一项所述的组合物或医药制剂，其中所述二核苷酸帽结构包括Cap0或Cap1结构。 23.如权利要求14-21中任一项所述的组合物或医药制剂，其中所述二核苷酸帽结构选自由以下组成的组：(m7)GpppG(“Ecap0”)、(m7)Gppp(2’-O)G(“Ecap1”)、(m27,3’-O)GpppG(“ARCA”或“D1”)和(m27,2’-O)GppSpG(“β-S-ARCA”)。 24.一种包含RNA多核苷酸的组合物或医药制剂，所述RNA多核苷酸包含： 5'帽；包含所述RNA多核苷酸的位置+1、+2、+3、+4和+5的帽近端序列；以及编码有效负载的序列，其中： (i)所述5'帽是m2(7,3′O)Gppp(m2′O)A1pG2，其中A1是所述RNA多核苷酸的位置+1，并且G2是所述RNA多核苷酸的位置+2；并且 (ii)所述帽近端序列包含： 所述5'帽的A1和G2以及包含分别在所述RNA多核苷酸的位置+3、+4和+5处的N3N4N5的序列，其中N3是C，N4是G，并且N5选自：A、C、G和U。 25.如权利要求1-22中任一项所述的组合物或医药制剂，其中N4是A。 26.如权利要求1-22中任一项所述的组合物或医药制剂，其中N4是C。 27.如权利要求1-22中任一项所述的组合物或医药制剂，其中N4是G。 28.如权利要求1-22中任一项所述的组合物或医药制剂，其中N4是U。 29.如权利要求1-27中任一项所述的组合物或医药制剂，其中N5是A。 30.如权利要求1-27中任一项所述的组合物或医药制剂，其中N5是C。 31.如权利要求1-27中任一项所述的组合物或医药制剂，其中N5是G。 32.如权利要求1-27中任一项所述的组合物或医药制剂，其中N5是U。 33.一种体外转录反应，所述体外转录反应包括： (i)包含与权利要求1或12中提供的RNA多核苷酸序列互补的多核苷酸序列的模板DNA链，其中所述模板DNA链包含与AUA转录起始位点互补的序列； (ii)聚合酶； (iii)核糖核苷酸；和 (iv)包含N1pN2的5'帽； 其中N1是A并且N2是U。 34.一种体外转录反应，所述体外转录反应包括： (i)包含与权利要求2-3或13中任一项中提供的RNA多核苷酸序列互补的多核苷酸序列的模板DNA链，其中所述模板DNA链包含与GCG转录起始位点互补的序列； (ii)聚合酶； (iii)核糖核苷酸；和 (iv)包含N1pN2的5'帽； 其中N1是A、C、G或U，并且N2是G；或者 其中N1是G并且N2是C；并且 其中所述模板链中与GCG互补的所述序列是RNA聚合酶转录的起始位点。 35.如权利要求32或33所述的体外转录反应，其中所述5'帽结构具有结构：G*N1pN2，其中 G*包含式(I)的结构： 或其盐， 其中 R2和R3各自是-OH或-OCH3；并且 X是O或S。 36.如权利要求34所述的体外转录反应，其中R2是-OH。 37.如权利要求34所述的体外转录反应，其中R2是-OCH3。 38.如权利要求34-36中任一项所述的体外转录反应，其中R3是-OH。 39.如权利要求34-37中任一项所述的体外转录反应，其中R3是-OCH3。 40.如权利要求34-38中任一项所述的体外转录反应，其中X是O。 41.如权利要求32-39中任一项所述的体外转录反应，其中所述三核苷酸帽结构包括Cap0或Cap1结构。 42.如权利要求32-39中任一项所述的体外转录反应，其中所述三核苷酸帽结构包括(m2’-O)N1pN2。 43.如权利要求32所述的体外转录反应，其中所述三核苷酸帽结构是(m7)Gppp(m2’-O)ApU。 44.如权利要求33所述的体外转录反应，其中所述三核苷酸帽结构选自由以下组成的组：(m27,3’-O)Gppp(m2’-O)ApG(“CleanCap AG”、“CC413”)、(m27,3’-O)Gppp(m2’-O)GpG(“CleanCap GG”)、(m7)Gppp(m2’-O)ApG和(m27,3’-O)Gppp(m26,2’-O)ApG。 45.一种体外转录反应，所述体外转录反应包括： (i)包含与权利要求14-21中任一项中提供的RNA多核苷酸序列互补的多核苷酸序列的模板DNA链，其中所述模板DNA链包含与转录起始位点互补的序列，所述转录起始位点包括GCG； (ii)聚合酶； (iii)核糖核苷酸；和 (iv)5'二核苷酸帽； 其中所述模板DNA链中与所述转录起始位点互补的所述序列是RNA聚合酶转录的起始位点。 46.一种RNA多核苷酸，所述RNA多核苷酸由权利要求32-44中任一项中提供的体外转录反应产生。 47.一种制备加帽RNA多核苷酸的方法，所述方法包括： 在核糖核苷酸和包含A1pU2结构的帽存在下转录模板DNA链，其中所述模板DNA链包含RNA聚合酶启动子序列以及包含位置+1、+2、+3、+4和+5(以3'至5'方向)的序列，其中所述模板DNA链的所述位置+1、+2、+3与AUA转录起始位点互补(即，所述模板DNA链的位置+1是T，所述模板DNA链的位置+2是A；并且所述模板DNA链的位置+3是T)；并且其中所述模板DNA链的位置+4和+5各自独立地是任何核苷酸，从而产生加帽RNA多核苷酸。 48.一种制备加帽RNA多核苷酸的方法，所述方法包括： 在核糖核苷酸和包含G1pC2结构的帽存在下转录模板DNA链，其中所述模板DNA链包含RNA聚合酶启动子序列以及包含位置+1、+2、+3、+4和+5(以3'至5'方向)的序列，其中所述模板DNA链的所述位置+1、+2、+3与GCG转录起始位点互补(即，所述模板DNA链的位置+1是C，所述模板DNA链的位置+2是G；并且所述模板DNA链的位置+3是C)；并且其中所述模板DNA链的位置+4和+5各自独立地是任何核苷酸，从而产生加帽RNA多核苷酸。 49.一种制备加帽RNA多核苷酸的方法，所述加帽RNA多核苷酸包含： 包含N1的5'二核苷酸帽结构；包含所述RNA多核苷酸的位置+1、+2、+3、+4和+5的帽近端序列；以及编码有效负载的序列，其中： 所述帽近端序列包含所述5'帽的N1，以及N2、N3、N4和N5，其中N1至N5对应于所述RNA多核苷酸的位置+1、+2、+3、+4和+5，其中N1是G，N2是U或C，并且N3、N4和N5各自独立地选自：A、C、G和U； 其中所述方法包括在所述5'帽和RNA聚合酶存在下转录模板DNA链。 50.如权利要求46-48中任一项所述的方法，其中所述模板DNA链的位置+4和+5各自独立地是A、C、G或T。 51.如权利要求46-49中任一项所述的方法，所述方法还包括纯化所述加帽RNA多核苷酸。 52.一种复合物，所述复合物包含模板DNA链和包含N1pN2结构的5'帽，其中所述DNA模板链包含RNA聚合酶启动子序列以及包含位置+1、+2、+3、+4和+5(以3'至5'方向)的序列，其中所述模板DNA链的所述位置+1、+2和+3与编码DNA链的转录起始位点互补； 其中N1和N2各自独立地选自：A、C、G和U； 其中N2与所述模板DNA链的所述+1位置(与所述转录起始位点的第一个核苷酸互补)相互作用，并且N1不与所述模板DNA链的所述+1位置相互作用； 其中所述模板DNA链的所述+4和+5位置各自独立地选自：A、C、G和U，并且 其中所述模板DNA链中与所述转录起始位点互补的所述序列(即，所述模板DNA链的位置+1、+2、+3)是RNA聚合酶转录的起始位点。 53.如权利要求51所述的复合物，其中： N1是A并且N2是G，并且其中所述模板DNA链的所述+1位置是C； N1是U并且N2是G，并且其中所述模板DNA链的所述+1位置是C；或者 N1是C并且N2是G，并且其中所述模板DNA链的所述+1位置是C。 54.一种复合物，所述复合物包含模板DNA链和包含N1pN2结构的5'帽，其中所述DNA模板链包含RNA聚合酶启动子序列以及包含位置+1、+2、+3、+4和+5(以3'至5'方向)的序列，其中所述模板DNA链的所述位置+1、+2和+3与编码DNA链的转录起始位点互补； 其中N1和N2各自独立地选自：A、C、G和U； 其中N1与所述模板DNA链的所述+1位置(与所述转录起始位点的第一个核苷酸互补)相互作用，并且N2与所述模板DNA链的所述+2位置(与所述转录起始位点的第二个核苷酸互补)相互作用； 其中所述模板DNA链的所述+4和+5位置各自独立地选自：A、C、G和U，并且 其中所述模板DNA链中与所述转录起始位点互补的所述序列(即，所述模板DNA链的位置+1、+2、+3)是RNA聚合酶转录的起始位点。 55.如权利要求53所述的复合物，其中N2是U或C，并且所述模板DNA链的所述+2位置是A或G。 56.如权利要求53或54所述的复合物，其中N3是A或G，并且所述模板DNA链的所述+3位置是T或C。 57.如权利要求53所述的复合物，其中： N1是A并且N2是G，并且所述模板DNA链的位置+1是T并且所述模板DNA链的位置+2是C； N1是G并且N2是C，并且所述模板DNA链的位置+1和位置+2分别是C和G；或者 N1是A并且N2是U，并且所述模板DNA链的位置+1和位置+2分别是T和A。 58.一种复合物，所述复合物包含模板DNA链和包含N1结构的5'帽，其中所述模板DNA链包含RNA聚合酶启动子序列以及包含位置+1、+2、+3、+4和+5(以3'至5'方向)的序列，其中所述模板DNA链的所述位置+1、+2和+3与编码DNA链的转录起始位点互补； 其中N1是G；并且 其中N1与所述模板DNA链的所述+1位置(与所述转录起始位点的第一个核苷酸互补)相互作用； 其中所述模板DNA链的所述+2位置(与所述转录起始位点的第二个核苷酸互补)是G或A； 其中所述模板DNA链的所述+4和+5位置各自独立地选自：A、C、G和U，并且 其中所述模板DNA链中与所述转录起始位点互补的所述序列是RNA聚合酶转录的起始位点。 59.如权利要求57所述的复合物，其中所述模板DNA链的所述+1位置是C，所述模板DNA链的所述+2位置是G，并且所述模板DNA链的所述+3位置是C。 60.一种配制药物组合物的方法，所述方法包括将包含权利要求1至31和45中任一项所述的RNA多核苷酸的制剂与包含脂质的制剂组合。 61.一种方法，所述方法包括：向受试者施用包含权利要求1-31和45中任一项所述的RNA多核苷酸的药物组合物。