Nme2Cas9镶嵌结构域融合蛋白
本发明涉及基因编辑领域。具体地，所述基因编辑是针对单核苷酸碱基编辑的。例如，此类单核苷酸碱基编辑使突变的碱基对转化为野生型碱基对。当前所公开的单核苷酸碱基基因编辑器的高准确性和精度是通过包含NmeCas9核酸酶和镶嵌核苷酸脱氨酶蛋白结构域的融合蛋白实现的。Nme2Cas9原间隔子相互作用结构域可以被SmuCas9原间隔子相互作用结构域置换。
发明专利
CN202280079681.8
2022-10-27
CN118339286A
2024-07-11
C12N9/22(2006.01)
马萨诸塞大学
埃里克·桑特海默;薛文;张涵;内森·巴米德勒;董小龙
美国
北京集佳知识产权代理有限公司
张福誉%韩晓帆
美国;US
1.一种融合蛋白，其包括Nme2Cas9蛋白和镶嵌核苷酸碱基编辑器(NBE)结构域。 2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述镶嵌NBE结构域是腺嘌呤碱基编辑器(ABE)结构域。 3.根据权利要求2所述的融合蛋白，其中所述镶嵌ABE结构域是镶嵌腺苷脱氨酶蛋白结构域。 4.根据权利要求3所述的融合蛋白，其中所述镶嵌腺苷脱氨酶蛋白结构域是腺苷脱氨酶8e蛋白结构域(ABE8e)。 5.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述镶嵌NBE结构域是胞苷碱基编辑器(CBE)结构域。 6.根据权利要求5所述的融合蛋白，其中所述镶嵌CBE结构域是镶嵌胞嘧啶脱氨酶蛋白结构域。 7.根据权利要求6所述的融合蛋白，其中所述胞嘧啶脱氨酶蛋白结构域选自由evoFERNY和rAPOBEC1组成的组。 8.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述Nme2Cas9蛋白包括原间隔子相邻基序相互作用结构域(PID)，所述PID具有与N4CC核苷酸序列或N4C核苷酸序列杂交的肽。 9.根据权利要求8所述的融合蛋白，其中所述PID是Nme2Cas9 PID或SmuCas9PID。 10.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白进一步包括核定位信号(NLS)蛋白，所述NLS蛋白选自由以下组成的组：核质蛋白NLS、SV40 NLS和C-myc NLS。 11.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白进一步包括尿嘧啶糖基化酶抑制剂。 12.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述Nme2Cas9蛋白包括突变。 13.根据权利要求12所述的融合蛋白，其中所述突变是D16A突变。 14.根据权利要求13所述的融合蛋白，其中所述Nme2Cas9(D16A)是切口酶。 15.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述Nme2Cas9蛋白包括位于至少一个镶嵌结构域蛋白的侧翼的接头。 16.根据权利要求15所述的融合蛋白，其中所述接头的长度为大约73个氨基酸。 17.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述接头的长度为大约20个氨基酸。 18.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述接头是3xHA标签。 19.一种腺相关病毒(AAV)，其包括编码融合蛋白的载体，所述融合蛋白包括Nme2Cas9蛋白和镶嵌核苷酸碱基编辑器(NBE)结构域。 20.根据权利要求19所述的AAV，其中所述镶嵌NBE结构域是腺嘌呤碱基编辑器(ABE)结构域。 21.根据权利要求20所述的AAV，其中所述镶嵌ABE结构域是镶嵌腺苷脱氨酶蛋白结构域。 22.根据权利要求21所述的AAV，其中所述镶嵌腺苷脱氨酶蛋白结构域是腺苷脱氨酶8e蛋白(ABE8e)。 23.根据权利要求19所述的AAV，其中所述镶嵌NBE结构域是胞苷碱基编辑器(CBE)结构域。 24.根据权利要求23所述的AAV，其中所述镶嵌CBE蛋白结构域是镶嵌胞嘧啶脱氨酶蛋白结构域。 25.根据权利要求24所述的AAV，其中所述胞嘧啶脱氨酶蛋白选自由evoFERNY和rAPOBEC1组成的组。 26.根据权利要求19所述的AAV，其中所述Nme2Cas9蛋白包括原间隔子相邻基序相互作用结构域(PID)，所述PID具有与N4CC核苷酸序列或N4C核苷酸序列杂交的肽。 27.根据权利要求26所述的AAV，其中所述PID是Nme2Cas9 PID或SmuCas9 PID。 28.根据权利要求19所述的AAV，其中所述AAV是腺相关病毒8。 29.根据权利要求19所述的AAV，其中所述AAV是腺相关病毒6。 30.根据权利要求19所述的AAV，其中所述融合蛋白进一步包括核定位信号(NLS)蛋白，所述NLS蛋白选自由以下组成的组：核质蛋白NLS和/或SV40 NLS和/或C-myc NLS。 31.根据权利要求19所述的AAV，其中所述融合蛋白进一步包括尿嘧啶糖基化酶抑制剂。 32.根据权利要求19所述的AAV，其中所述Nme2Cas9蛋白包括突变。 33.根据权利要求32所述的AAV，其中所述突变是D16A突变。 34.根据权利要求33所述的AAV，其中所述Nme2Cas9(D16A)蛋白是切口酶。 35.根据权利要求19所述的AAV，其中所述Nme2Cas9蛋白包括位于至少一个镶嵌结构域蛋白的侧翼的接头。 36.根据权利要求35所述的AAV，其中所述接头的长度为大约73个氨基酸。 37.根据权利要求35所述的AAV，其中所述接头的长度为大约20个氨基酸。 38.根据权利要求35所述的AAV，其中所述接头是3xHA标签。 39.一种方法，其包括： a)提供： i)患者，所述患者表现出遗传性疾病的至少一种症状；以及 ii)腺相关病毒(AAV)，所述AAV包括编码融合蛋白的载体，所述融合蛋白包括Nme2Cas9蛋白和镶嵌核苷酸碱基编辑器(NBE)结构域； b)在使得所述遗传性疾病的所述至少一种症状减少的条件下用所述腺相关病毒治疗所述患者。 40.根据权利要求39所述的方法，其中所述遗传性疾病是由具有突变的单碱基的基因引起的，其中所述基因侧接有N4CC核苷酸序列或N4C核苷酸序列。 41.根据权利要求40所述的方法，其中所述Nme2Cas9蛋白包括原间隔子相邻基序相互作用结构域(PID)，所述PID具有与所述N4CC核苷酸序列或所述N4C核苷酸序列杂交的肽。 42.根据权利要求39所述的方法，其中所述治疗用野生型单碱基置换所述突变的单碱基。 43.根据权利要求39所述的方法，其中所述镶嵌NBE结构域是腺嘌呤碱基编辑器(ABE)结构域。 44.根据权利要求43所述的方法，其中所述镶嵌ABE结构域是镶嵌腺苷脱氨酶蛋白结构域。 45.根据权利要求44所述的方法，其中所述镶嵌腺苷脱氨酶蛋白结构域是腺苷脱氨酶8e蛋白(ABE8e)。 46.根据权利要求39所述的方法，其中所述镶嵌NBE结构域是胞苷碱基编辑器(CBE)结构域。 47.根据权利要求46所述的方法，其中所述镶嵌CBE蛋白结构域是镶嵌胞嘧啶脱氨酶蛋白结构域。 48.根据权利要求47所述的方法，其中所述胞嘧啶脱氨酶蛋白是evoFERNY或rAPOBEC1。 49.根据权利要求39所述的方法，其中所述Nme2Cas9蛋白包括原间隔子相邻基序相互作用结构域(PID)，所述PID具有与N4CC核苷酸序列或N4C核苷酸序列杂交的肽。 50.根据权利要求49所述的方法，其中所述PID是Nme2Cas9 PID或SmuCas9 PID。 51.根据权利要求39所述的方法，其中所述AAV是腺相关病毒8。 52.根据权利要求39所述的方法，其中所述AAV是腺相关病毒6。 53.根据权利要求39所述的方法，其中所述融合蛋白进一步包括核定位信号(NLS)蛋白，所述NLS蛋白选自由以下组成的组：核质蛋白NLS、SV40 NLS和C-myc NLS。 54.根据权利要求39所述的方法，其中所述融合蛋白进一步包括尿嘧啶糖基化酶抑制剂。 55.根据权利要求39所述的方法，其中所述Nme2Cas9蛋白包括突变。 56.根据权利要求55所述的方法，其中所述突变是D16A突变。 57.根据权利要求56所述的方法，其中所述Nme2Cas9(D16A)蛋白是切口酶。 58.根据权利要求39所述的方法，其中所述Nme2Cas9蛋白包括位于至少一个镶嵌结构域蛋白的侧翼的接头。 59.根据权利要求58所述的方法，其中所述接头的长度为大约73个氨基酸。 60.根据权利要求58所述的方法，其中所述接头的长度为大约20个氨基酸。 61.根据权利要求58所述的方法，其中所述接头是3xHA标签。 62.根据权利要求39所述的方法，其中所述遗传性疾病选自由以下组成的组：酪氨酸血症、肌营养不良症、雷特综合征(Rett syndrome)、巴顿病(Batten disease)或肌萎缩性侧索硬化症(ALS)。 63.一种方法，其包括： a)提供： i)患者，所述患者包括具有突变的单碱基的基因，其中所述基因侧接有N4CC核苷酸序列或N4C核苷酸序列；以及 ii)腺相关病毒(AAV)，所述AAV包括编码融合蛋白的载体，所述融合蛋白包括Nme2Cas9蛋白和镶嵌核苷酸脱氨酶蛋白结构域； b)在使得所述突变的单碱基被野生型单碱基置换并且不发展遗传性疾病的条件下用所述腺相关病毒治疗所述患者。 64.根据权利要求63所述的方法，其中所述遗传性疾病选自由以下组成的组：酪氨酸血症、肌营养不良症、雷特综合征、巴顿病和肌萎缩性侧索硬化症(ALS)。 65.根据权利要求63所述的方法，其中所述Nme2Cas9蛋白包括原间隔子相邻基序相互作用结构域(PID)，所述PID具有与所述N4CC核苷酸序列或所述N4C核苷酸序列杂交的肽。 66.根据权利要求65所述的方法，其中所述PID是Nme2Cas9 PID或SmuCas9 PID。 67.根据权利要求63所述的方法，其中所述镶嵌核苷酸脱氨酶蛋白结构域是镶嵌腺苷脱氨酶蛋白结构域。 68.根据权利要求67所述的方法，其中所述镶嵌腺苷脱氨酶蛋白结构域是腺苷脱氨酶8e蛋白(ABE8e)结构域。 69.根据权利要求63所述的方法，其中所述镶嵌核苷酸脱氨酶蛋白结构域是镶嵌胞嘧啶脱氨酶蛋白结构域。 70.根据权利要求69所述的方法，其中所述胞嘧啶脱氨酶蛋白结构域是evoFERNY或rAPOBEC1。 71.根据权利要求63所述的方法，其中所述AAV是腺相关病毒8。 72.根据权利要求63所述的方法，其中所述AAV是腺相关病毒6。 73.根据权利要求63所述的方法，其中所述融合蛋白进一步包括核定位信号(NLS)蛋白，所述NLS蛋白选自由以下组成的组：核质蛋白NLS、SV40 NLS和C-myc NLS。 74.根据权利要求63所述的方法，其中所述融合蛋白进一步包括尿嘧啶糖基化酶抑制剂。 75.根据权利要求63所述的方法，其中所述Nme2Cas9蛋白包括突变。 76.根据权利要求75所述的方法，其中所述突变是D16A突变。 77.根据权利要求63所述的方法，其中所述Nme2Cas9(D16A)蛋白是切口酶。 78.根据权利要求63所述的方法，其中所述Nme2Cas9蛋白包括位于至少一个镶嵌蛋白结构域的侧翼的接头。 79.根据权利要求78所述的方法，其中所述接头的长度为大约73个氨基酸。 80.根据权利要求78所述的方法，其中所述接头的长度为大约20个氨基酸。 81.根据权利要求78所述的方法，其中所述接头是3xHA标签。 82.根据权利要求63所述的方法，其中所述基因选自由以下组成的组：Fah基因、Dmd基因、MeCP2基因、CLN3基因和SOD1基因。