DNA:RNA双链体断裂的用途

摘要：

提供了由RNA产生eDNA的方法，所述方法涉及DNA/RNA复合物的切割。

专利类型：发明专利

申请/专利号：CN202280078844.0

申请日期：2022-11-30

公开/公告号：CN118339306A

公开/公告日：2024-07-11

主分类号：C12P19/34(2006.01)

申请/专利权人:生物辐射实验室股份有限公司

发明/设计人:R·拉坦;J·佩里;M·冈萨雷兹-普拉斯基;S·斯庞

主申请人地址:美国加利福尼亚州

专利代理机构:上海专利商标事务所有限公司

代理人:陈扬扬%陶家蓉

国别省市代码:美国;US

权利要求：

1.一种由RNA产生cDNA的方法，所述方法包括： 通过使所述RNA与粘接到所述RNA的一个或多个引物接触并且用逆转录酶延伸所述引物，由所述RNA产生第一链cDNA，由此形成DNA/RNA复合物； 用至少一种限制性酶或核酸内切酶切割所述DNA/RNA复合物，所述至少一种限制性酶或核酸内切酶切割所述DNA/RNA复合物并且留下3′DNA端和5′RNA端； 将5′磷酸化寡核苷酸与所述3′DNA端连接以形成5′-3′包括以下的第一链cDNA：所述引物、第一链cDNA和所述寡核苷酸；以及 扩增所述第一链cDNA。 2.根据权利要求1所述的方法，其中所述RNA是mRNA。 3.根据权利要求1所述的方法，其中所述连接包括将包括5′磷酸化端的双链寡核苷酸粘接到所述3′DNA端处的序列，并且使经粘接的寡核苷酸与连接酶接触，由此将所述寡核苷酸的所述5′磷酸化端与所述3′DNA端连接。 4.根据权利要求3所述的方法，其中经切割的DNA/RNA复合物的所述3′DNA端处的所述序列是单链突出端。 5.根据权利要求3所述的方法，其中在所述切割之后和在所述连接之前，所述DNA/RNA复合物解离。 6.根据权利要求5所述的方法，其中所述DNA/RNA复合物通过热量解离。 7.根据权利要求1所述的方法，其中所述5′RNA端是单链突出端；并且 所述连接包括将5′磷酸化寡核苷酸粘接到5′RNA突出端序列，并且使经粘接的寡核苷酸与连接酶接触，由此将所述寡核苷酸与所述3′DNA端连接。 8.根据权利要求1所述的方法，其中所述产生、所述切割、所述连接和所述扩增发生在单个反应容器中。 9.根据权利要求1所述的方法，其中所述引物包括粘接到所述mRNA上的3′poly A序列的poly dT 3′端。 10.根据权利要求1所述的方法，其中所述引物包括特异性地粘接到特定mRNA的基因特异性3′端。 11.根据权利要求1所述的方法，其中一个或多个引物包括具有不同基因特异性3′端的多个引物，所述基因特异性3′端特异性地粘接到不同的特定mRNA。 12.根据权利要求1所述的方法，其中在所述切割之后和在所述连接之前，对经切割的DNA/RNA复合物进行端修复。 13.根据权利要求12所述的方法，其中所述端修复包括使所述经切割的DNA/RNA复合物与碱性磷酸酶接触。 14.根据权利要求1所述的方法，其包括用所述至少一种限制性酶切割所述DNA/RNA复合物。 15.根据权利要求15所述的方法，其中所述限制性酶选自由以下组成的组：AvaII、AvrII、BanI、BstNI、MvaI、HaeIII、HinfI、NciI、PFLMI、Sau3AI和TaqI。 16.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一种限制性酶包括识别不同识别序列的两种或更多种限制性酶。 17.根据权利要求16所述的方法，其中所述两种或更多种限制性酶选自由以下组成的组：AvaII、AvrII、BanI、BstNI、MvaI、HaeIII、HinfI、NciI、PFLMI、Sau3AI和TaqI。 18.根据权利要求1所述的方法，其包括用所述至少一种核酸内切酶切割所述DNA/RNA复合物。 19.根据权利要求18所述的方法，其中所述至少一种核酸内切酶是NUC1。 20.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述产生、所述切割、所述粘接和所述连接在多个分区中进行。 21.根据权利要求20所述的方法，其中所述分区是液滴或孔。 22.根据权利要求20所述的方法，其中所述分区是透化细胞和固定细胞。 23.根据权利要求20或21或22所述的方法，其中在所述连接之后和在所述扩增之前组合所述分区的内含物。 24.根据权利要求1至23中任一项所述的方法，其中所述引物包括条形码和第一PCR柄序列。 25.根据权利要求24所述的方法，其中所述条形码是唯一分子标识符(UMI)。 26.根据权利要求20至23中任一项所述的方法，其中所述引物包括分区特异性条形码和第一PCR柄序列。 27.根据权利要求26所述的方法，其中所述引物进一步包括唯一分子标识符(UMI)。 28.根据权利要求1至27中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸5′-3′包括：所述5′RNA突出端序列的反向补体和第二PCR柄或其片段或至少三个连续核苷酸。 29.根据权利要求1至28中任一项所述的方法，其中所述扩增包括聚合酶链反应(PCR)。 30.根据权利要求1至28中任一项所述的方法，其中所述扩增包括等温扩增。