PAH调节性组合物和方法
本披露提供了例如用于在细胞、组织或受试者中的DNA序列的一个或多个位置处靶向、编辑、修饰或操纵宿主细胞基因组的组合物、系统和方法。描述了用于治疗苯丙酮尿症(PKU)的基因修饰系统。
发明专利
CN202280074260.6
2022-09-06
CN118434855A
2024-08-01
C12N15/113(2006.01)
旗舰先锋创新VI有限责任公司
R·C·阿尔特舒勒;A·H·博思默;D·R·吉;C·G·S·科特拉-拉穆西诺;K·金;R·M·科特拉尔;G·D·迈克阿利斯特;A·雷;N·罗奎特;C·桑切斯;B·E·斯特因伯格;W·E·萨洛蒙;R·J·希特里克;W·奎尔毕斯;L·H·阿波尼;Z·王
美国马萨诸塞州
北京市柳沈律师事务所
秦剑
美国;US
1.一种模板RNA，其从5’至3’包含： (i)与人类PAH基因的第一部分互补的gRNA间隔子，其中该gRNA间隔子具有包含表1A、表1B、表1C或表1D的gRNA间隔子序列的核心核苷酸的序列，并且任选地包含从该gRNA间隔子的侧翼核苷酸的3’端开始的一个或多个连续核苷酸，或者其中该gRNA间隔子具有选自表5A-5F、8A-8D、E3、E3A、BB、E5、E5A、E6或E6A的间隔子的序列； (ii)结合基因修饰多肽(例如，结合该基因修饰多肽的Cas结构域)的gRNA支架， (iii)包含突变区的异源对象序列，用于将突变引入该人类PAH基因的第二部分(例如，纠正其中的突变)(其中，任选地，该异源对象序列从5’至3’包含编辑后同源区、突变区和编辑前同源区)，以及 (iv)引物结合位点(PBS)序列，其包含与该人类PAH基因的第三部分具有100％同一性的至少5、6、7或8个碱基。 2.如权利要求1所述的模板RNA，其中该异源对象序列包含表3A、表3B、表3C或表3D中RT模板序列的核心核苷酸，并且任选地包含从该RT模板序列的侧翼核苷酸的3’端开始的一个或多个连续核苷酸，或者其中该异源对象序列包含表5A-5F、8A-8D、E3、E3A、BB、E5、E5A、E6或E6A中RT模板序列的序列。 3.如权利要求1所述的模板RNA，其中该异源对象序列包含对应于该gRNA间隔子序列的表3A、表3B、表3C或表3D中RT模板序列的核心核苷酸，并且任选地包含从该RT模板序列的侧翼核苷酸的3’端开始的一个或多个连续核苷酸，或者其中该异源对象序列包含表5A-5F、8A-8D、E3、E3A、BB、E5、E5A、E6或E6A中RT模板序列的序列。 4.一种模板RNA，其从5’至3’包含： (i)与人类PAH基因的第一部分互补的gRNA间隔子， (ii)结合基因修饰多肽(例如，结合该基因修饰多肽的Cas结构域)的gRNA支架， (iii)包含突变区的异源对象序列，用于将突变引入该人类PAH基因的第二部分(例如，纠正其中的突变)，其中该异源对象序列包含表3A、表3B、表3C或表3D中RT模板序列的核心核苷酸，并且任选地包含从该RT模板序列的侧翼核苷酸的3’端开始的一个或多个连续核苷酸，或者其中该异源对象序列包含表5A-5F、8A-8D、E3、E3A、BB、E5、E5A、E6或E6A中的RT模板序列；以及 (iv)PBS序列，其包含与该人类PAH基因的第三部分具有100％同一性的至少5、6、7或8个碱基。 5.如权利要求4所述的模板RNA，其中该gRNA间隔子包含表1A、表1B、表1C或表1D中gRNA间隔子序列的核心核苷酸，并且任选地包含从该gRNA间隔子序列的侧翼核苷酸的3’端开始的一个或多个连续核苷酸，或者其中该gRNA间隔子包含表5A-5F、8A-8D、E3、E3A、BB、E5、E5A、E6或E6A中的gRNA间隔子序列。 6.如权利要求1-5中任一项所述的模板RNA，其中该gRNA间隔子包含ACCTCAATCCTTTGGGTGTA(SEQ ID NO：16355)。 7.如权利要求1-5中任一项所述的模板RNA，其中该gRNA间隔子包含CCTCAATCCTTTGGGTGTAT(SEQ ID NO：16332)。 8.如权利要求1-5中任一项所述的模板RNA，其中该gRNA间隔子包含TGGGTCGTAGCGAACTGAGA(SEQ ID NO：16102)。 9.如权利要求1-5中任一项所述的模板RNA，其中该gRNA间隔子包含GGGTCGTAGCGAACTGAGAA(SEQ ID NO：16084)。 10.如权利要求1-5中任一项所述的模板RNA，其中该gRNA间隔子包含TAGCGAACTGAGAAGGGCCA(SEQ ID NO：16011)。 11.如权利要求1-5中任一项所述的模板RNA，其中该gRNA间隔子包含ACTTTGCTGCCACAATACCT(SEQ ID NO：16032)。 12.如权利要求5所述的模板RNA，其中该异源对象序列包含对应于该RT模板序列的表1A、表1B、表1C或表1D中gRNA间隔子序列的核心核苷酸，并且任选地包含从该gRNA间隔子序列的侧翼核苷酸的3’端开始的一个或多个连续核苷酸，或者其中该异源对象序列包含对应于该RT模板序列或相对于其具有1、2或3个取代的序列的表5A-5F、8A-8D、E3、E3A、BB、E5、E5A、E6或E6A中gRNA间隔子序列的核苷酸。 13.如权利要求1-12中任一项所述的模板RNA，其中该PBS序列具有包含来自表3A、表3B、表3C或表3D中与该RT模板序列同一行的PBS序列的核心核苷酸的序列，并且任选地包含从该PBS序列的侧翼核苷酸的5’端开始的一个或多个连续核苷酸。 14.如权利要求1-12中任一项所述的模板RNA，其中该PBS序列具有包含对应于该RT模板序列、该gRNA间隔子序列或两者的表3A、表3B、表3C或表3D中PBS序列的核心核苷酸的序列，并且任选地包含从该PBS序列的侧翼核苷酸的5’端开始的一个或多个连续核苷酸，或其中该PBS序列具有包含对应于该RT模板序列、该gRNA间隔子序列或两者的表5A-5F、8A-8D、E3、E3A、BB、E5、E5A、E6或E6A中PBS序列的序列。 15.如权利要求1-14中任一项所述的模板RNA，其中该gRNA支架包含表12中gRNA支架的序列，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。 16.如权利要求1-14中任一项所述的模板RNA，其中该gRNA支架包含对应于该RT模板序列、该gRNA间隔子序列、或两者的表12中gRNA支架的序列，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。 17.如权利要求1-16中任一项所述的模板RNA，其中该突变是该PAH基因的W408R、Q261R、Q243R、和/或IVS10-11A＞G突变(例如，纠正致病性R408W、R261Q、R243Q、和/或IVS10-11G＞A突变)。 18.如权利要求1-17中任一项所述的模板RNA，其中编辑前序列长度包含约1个核苷酸至约35个核苷酸(例如，包含约1-5、5-10、10-15、15-20、20-25、25-30或30-35个核苷酸)。 19.如权利要求1-18中任一项所述的模板RNA，其中该突变区包含单核苷酸。 20.如权利要求1-18中任一项所述的模板RNA，其中该突变区长度为至少两个核苷酸。 21.如权利要求1-18或20中任一项所述的模板RNA，其中该突变区长度为高达32个(例如，高达5、10、15、20、25、30或32个)核苷酸，并且相对于该人类PAH基因的第二部分包含一个、两个或三个序列差异。 22.如权利要求1-18、20或21中任一项所述的模板RNA，其中该突变区相对于该人类PAH基因的第二部分包含两个序列差异。 23.如权利要求1-18或20-22中任一项所述的模板RNA，其中该突变区包含设计用于纠正该PAH基因中的致病性突变的第一区(例如，第一核苷酸)和设计用于灭活PAM序列(例如，如本文所述的“PAM-杀灭”突变)的第二区(例如，第二核苷酸)。 24.如权利要求1-23中任一项所述的模板RNA，其中该突变区与该人类PAH基因的对应部分包含小于80％、70％、60％、50％、40％或30％的同一性。 25.如权利要求1-23中任一项所述的模板RNA，其中该模板RNA包含一种或多种沉默突变(例如，沉默取代)，例如，如表7A-7C、8A-8D、E6或E6A中所例示的。 26.如前述权利要求中任一项所述的模板RNA，其中该突变区包含设计用于纠正该PAH基因中的致病性突变的第一区和设计用于引入沉默取代的第二区。 27.如权利要求1-26中任一项所述的模板RNA，其包含一个或多个化学修饰的核苷酸。 28.一种基因修饰系统，其包含： 如权利要求1-27中任一项所述的模板RNA；以及 基因修饰多肽或编码该基因修饰多肽的核酸(例如RNA)。 29.如权利要求28所述的基因修饰系统，其中该基因修饰多肽包含： 逆转录酶(RT)结构域(例如，来自逆转录病毒的RT结构域，或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸序列同一性的多肽结构域)；和 与靶DNA分子结合且与该RT结构域异源的Cas结构域(例如，Cas9结构域)；以及 任选地，布置在该RT结构域和该Cas结构域之间的接头。 30.如权利要求29所述的基因修饰系统，其中该RT结构域包括： (a)表6的RT结构域；或 (b)来自以下的RT结构域：鼠白血病病毒(MMLV)、猪内源逆转录病毒(PERV)、禽网状内皮组织增生病病毒(AVIRE)、猫白血病病毒(FLV)、猿泡沫病毒(SFV)(例如SFV3L)、牛白血病病毒(BLV)、梅森-菲舍猴病毒(MPMV)、人泡沫病毒(HFV)、或牛泡沫/合胞病毒(BFV/BSV)。 31.如权利要求29或30所述的基因修饰系统，其中该Cas结构域包括表7或表8的Cas结构域。 32.如权利要求29或30所述的基因修饰系统，其中该Cas结构域： (a)是Cas9结构域； (b)是SpCas9结构域、BlatCas9结构域、Nme2Cas9结构域、PnpCas9结构域、SauCas9结构域、SauCas9-KKH结构域、SauriCas9结构域、SauriCas9-KKH结构域、ScaCas9-Sc++结构域、SPyCas9结构域、SpyCas9-NG结构域、SpyCas9-SpRY结构域或St1Cas9结构域；和/或 (c)是包含N670A突变、N611A突变、N605A突变、N580A突变、N588A突变、N872A突变、N863突变、N622A突变或H840A突变的Cas9结构域。 33.如权利要求32所述的基因修饰系统，其中该Cas9结构域结合表7或表12中列出的PAM序列。 34.如权利要求33所述的基因修饰系统，其中该人类PAH基因的第二部分与该Cas结构域识别的PAM重叠，例如，其中该人类PAH基因的第二部分在该PAM内或其中该PAM在该人类PAH基因的第二部分内。 35.如权利要求28-34中任一项所述的基因修饰系统，其中该gRNA间隔子为根据表1A、表1B、表1C或表1D的gRNA间隔子，并且该Cas结构域包含表1A、表1B、表1C或表1D同一行中列出的Cas结构域，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。 36.如权利要求28-34中任一项所述的基因修饰系统，其中该模板RNA包含表5A-5F、8A-8D、E3、E3A、BB、E5、E5A、E6或E6A中模板RNA序列的序列，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。 37.如权利要求28-36中任一项所述的基因修饰系统，其中： (a)该模板RNA包含表3A-3D、5A-5F、8A-8D、E3、E3A、BB、E5、E5A、E6或E6A中模板RNA序列的序列； (b)该Cas结构域包括表7或表8的Cas结构域； (c)该接头包含表10的接头序列(例如SEQ ID NO：5217、5106、5190和5218中任一个的接头序列)；并且 (d)该基因修饰多肽包含来自表11的一个或两个NLS序列(例如SEQ ID NO：5245、5290、5323、5330、5349、5350、5351和4001中任一个的NLS序列)。 38.如权利要求28-37中任一项所述的基因修饰系统，其在该人类PAH基因的第一链中产生第一切口。 39.如权利要求38所述的基因修饰系统，其进一步包含第二链靶向性gRNA，该第二链靶向性gRNA将第二切口引导至该人类PAH基因的第二链。 40.如权利要求39所述的基因修饰系统，其中该第二链靶向性gRNA包含： (i)包含来自表2A、表2B、表2C或表2D的左gRNA间隔子序列或右gRNA间隔子序列的核心核苷酸的序列，并且任选地包含从该左gRNA间隔子序列或右gRNA间隔子序列的侧翼核苷酸的3’端开始的一个或多个连续核苷酸；或 (ii)包含表6A的间隔子序列或相对于其具有1、2或3个取代的间隔子序列的第二链靶向性gRNA。 41.如权利要求39所述的基因修饰系统，其中该第二链靶向性gRNA包含含有对应于(i)的gRNA间隔子序列的来自表2A、表2B、表2C或表2D的左gRNA间隔子序列或右gRNA间隔子序列的核心核苷酸的序列，并且任选地包含从该左gRNA间隔子序列或右gRNA间隔子序列的侧翼核苷酸的3’端开始的一个或多个连续核苷酸。 42.如权利要求39所述的基因修饰系统，其中该第二链靶向性gRNA包含含有来自表4A、表4B、表4C或表4D的第二切口gRNA序列的核心核苷酸的序列，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，并且任选地包含从该第二切口gRNA序列的侧翼核苷酸的3’端开始的一个或多个连续核苷酸；或 (ii)包含来自表6A的间隔子序列或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列的第二链靶向性gRNA。 43.如权利要求39所述的基因修饰系统，其中该第二链靶向性gRNA包含含有对应于(i)的gRNA间隔子序列的来自表4A、表4B、表4C或表4D的第二切口gRNA序列的核心核苷酸的序列，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，并且任选地包含从该第二切口gRNA序列的侧翼核苷酸的3’端开始的一个或多个连续核苷酸。 44.如权利要求39-43中任一项所述的基因修饰系统，其中该第二链靶向性gRNA与该基因修饰系统的模板RNA具有“PAM-在内取向”，例如，如表2A-2D、4A-4D或6A中所例示的。 45.如权利要求39-44中任一项所述的基因修饰系统，该第二链靶向性gRNA靶向与该模板RNA的靶突变重叠的序列。 46.如权利要求45所述的基因修饰系统，其中该第二链靶向性gRNA包含： (i)与PAH突变互补的序列(例如，间隔子序列)； (ii)与靶基因座处的野生型序列互补的序列(例如，间隔子序列)； (iii)与接近该靶基因座的SNP、例如受试者(例如，患者)的基因组DNA中包含的SNP互补的序列(例如，间隔子序列)； (iv)与接近该靶基因座的一个或多个沉默取代互补或包含该一个或多个沉默取代的序列(例如，间隔子序列)。 47.如前述权利要求中任一项所述的模板RNA或基因修饰系统，其中该gRNA间隔子包含该gRNA间隔子的约1、2、3或更多个侧翼核苷酸。 48.如前述权利要求中任一项所述的模板RNA或基因修饰系统，其中该异源对象序列包含该RT模板序列的约2、3、4、5、10、20、30、40或更多个侧翼核苷酸。 49.如前述权利要求中任一项所述的模板RNA或基因修饰系统，其中该异源对象序列包含约8-30、9-25、10-20、11-16或12-15个(例如约11-16个)核苷酸。 50.如前述权利要求中任一项所述的模板RNA或基因修饰系统，其中相对于该人类PAH基因的对应部分，该突变区包含1、2或3个核苷酸位置的序列差异。 51.如前述权利要求中任一项所述的模板RNA或基因修饰系统，其中相对于该人类PAH基因的对应部分，该突变区包含至少2个核苷酸位置的序列差异。 52.如前述权利要求中任一项所述的模板RNA或基因修饰系统，其中该编辑后同源区和/或编辑前同源区与该PAH基因包含100％同一性。 53.如前述权利要求中任一项所述的模板RNA或基因修饰系统，其中该PBS序列另外包含约1、2、3、4、5、6、7或更多个侧翼核苷酸。 54.如前述权利要求中任一项所述的模板RNA或基因修饰系统，其中该PBS序列包含约5-20、8-16、8-14、8-13、9-13、9-12或10-12个(例如约9-12个)核苷酸。 55.如前述权利要求中任一项所述的模板RNA或基因修饰系统，其中该PBS序列在该PAH基因切口位点的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸内结合。 56.如前述权利要求中任一项所述的基因修饰系统，其中该基因修饰多肽的结构域通过肽接头连接。 57.如权利要求56所述的基因修饰系统，其中该接头包含表10的接头序列(例如SEQ IDNO：5217、5106、5190和5218中任一个的接头序列)。 58.如前述权利要求中任一项所述的基因修饰系统，其中该基因修饰多肽进一步包含一个或多个核定位序列(NLS)。 59.如权利要求58所述的基因修饰系统，其中该基因修饰多肽包含第一NLS和第二NLS。 60.如权利要求58或59所述的基因修饰系统，其中该NLS包含表11的NLS序列(例如SEQID NO：5245、5290、5323、5330、5349、5350、5351和4001中任一个的序列)。 61.一种模板RNA，其包含表4A-4D、5A-5F、8A-8D、E3、E3A、BB、E5、E5A、E6或E6A中模板RNA的序列，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。 62.一种模板RNA，其包含表4A-4D、5A-5F、8A-8D、E3、E3A、BB、E5、E5A、E6或E6A中模板RNA的序列。 63.一种基因修饰系统，其包含： (iii)模板RNA，其包含表4A、表4B、表4C或表4D中模板RNA的序列，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列；以及 (iv)来自表4A、表4B、表4C或表4D中与(i)同一行的第二切口gRNA序列，与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。 64.一种基因修饰系统，其包含： (iii)模板RNA，其包含表4A、表4B、表4C或表4D中模板RNA的序列；以及 (iv)来自表4A、表4B、表4C或表4D中与(i)同一行的第二切口gRNA序列。 65.一种DNA，其编码如权利要求1-27、48-55、61或62中任一项所述的模板RNA，或如权利要求28-60、63或64中任一项所述的基因修饰系统。 66.一种药物组合物，其包含如权利要求28-60、63或64中任一项所述的系统，或编码该系统的一种或多种核酸，以及药学上可接受的赋形剂或载剂。 67.如权利要求66所述的药物组合物，其中该药学上可接受的赋形剂或载剂选自由以下组成的组：质粒载体、病毒载体、囊泡和脂质纳米颗粒。 68.如权利要求67所述的药物组合物，其中该病毒载体是腺相关病毒。 69.一种宿主细胞(例如哺乳动物细胞，例如人细胞)，其包含如前述权利要求中任一项所述的模板RNA或基因修饰系统。 70.一种制备如权利要求1-27、48-55、61或62中任一项所述的模板RNA的方法，该方法包括通过以下来合成该模板RNA：通过体外转录(例如固态合成)或通过在允许产生该模板RNA的条件下将编码该模板RNA的DNA引入宿主细胞。 71.一种用于修饰细胞中人类PAH基因中的靶位点的方法，该方法包括使该细胞与如权利要求28-60、63或64中任一项所述的基因修饰系统或编码该基因修饰系统的DNA接触，从而修饰细胞中该人类PAH基因中的靶位点。 72.一种用于治疗患有与人类PAH基因突变相关的疾病或病况的受试者的方法，该方法包括向该受试者施用如权利要求28-60、63或64中任一项所述的基因修饰系统或编码该基因修饰系统的DNA，从而治疗该患有与人类PAH基因突变相关的疾病或病况的受试者。 73.如权利要求71或72所述的方法，其中该疾病或病况是苯丙酮尿症(PKU)或高苯丙氨酸血症(例如，轻度或重度高苯丙氨酸血症)。 74.如权利要求72-73中任一项所述的方法，其中该受试者具有R408W、R261Q、R243Q和/或IVS10-11G＞A突变。 75.一种用于治疗患有PKU的受试者的方法，该方法包括向该受试者施用如权利要求28-60、63或64中任一项所述的基因修饰系统或编码该基因修饰系统的DNA，从而治疗该患有PKU的受试者。 76.如前述权利要求中任一项所述的基因修饰系统或方法，其中将该系统引入靶细胞可纠正该PAH基因的致病性突变。 77.如前述权利要求中任一项所述的基因修饰系统或方法，其中该致病性突变是R408W、R261Q、R243Q和/或IVS10-11G＞A突变，并且其中该纠正包括W408R、Q261R和/或Q243R的氨基酸取代，或IVS10-11A＞G的核苷酸取代。 78.如前述权利要求中任一项所述的基因修饰系统或方法，其中将该系统引入靶细胞会导致突变，该突变促使恢复该PAH基因的功能。 79.如前述权利要求中任一项所述的基因修饰系统或方法，其中该突变的纠正发生在至少30％(例如，30％、40％、50％、60％、70％或更多)的靶核酸中。 80.如前述权利要求中任一项所述的基因修饰系统或方法，其中该突变的纠正发生在至少30％(例如，30％、40％、50％、60％、70％或更多)的靶细胞中。 81.如前述权利要求中任一项所述的基因修饰系统或方法，其中该基因修饰系统包含第二链靶向性gRNA，并且其中相对于用包含模板RNA而无第二链靶向性gRNA的基因修饰系统处理的靶细胞群体，靶细胞群体中突变的纠正增加。 82.如前述权利要求中任一项所述的基因修饰系统或方法，其中该模板RNA包含一个或多个沉默取代(例如，如表7A、X4和X4A中例示的)，并且其中相对于用包含不含有一个或多个沉默取代的模板RNA的基因修饰系统处理的靶细胞群体，靶细胞群体中突变的纠正增加。 83.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该细胞是哺乳动物细胞，例如人细胞。 84.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该受试者是人。 85.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该接触离体发生，例如，其中该细胞或受试者的DNA离体修饰。 86.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该接触在体内发生，例如，其中该细胞或受试者的DNA在体内修饰。 87.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中使该细胞或该受试者与该系统接触包括在允许产生该基因修饰多肽的条件下使该细胞或该受试者体内的细胞与编码该基因修饰多肽的核酸(例如DNA或RNA)接触。