II类V型CRISPR系统
本文中描述了可用于基因编辑的衍生自未培养的微生物的方法、组合物和系统。
发明专利
CN202280046084.5
2022-06-01
CN117693585A
2024-03-12
C12N15/10(2006.01)
宏基因组学公司
布莱恩·托马斯;克利斯多佛·布朗;奥德拉·德沃托;克里斯蒂娜·布特弗尔德;利萨·亚历山大;丹妮拉·S·A·戈尔茨曼
美国加利福尼亚州
北京安信方达知识产权代理有限公司
徐爱文%武晶晶
美国;US
1.一种破坏细胞中的CD38基因座的方法，所述方法包括向所述细胞中引入： (a)2类V型Cas核酸内切酶；以及 (b)工程化向导RNA，其中所述工程化向导RNA被配置成与所述核酸内切酶形成复合物，并且所述工程化向导RNA包括被配置成与所述CD38基因座的区杂交的间隔子序列， 其中所述工程化向导RNA被配置成与具有与SEQ ID NO：4466-4503和5686中的任一者具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的至少20-22个连续核苷酸的序列杂交；或者 其中所述工程化向导RNA包括与SEQ ID NO：4428-4465和5685中的任一者具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的核苷酸序列。 2.根据权利要求1所述的方法，其中所述2类V型Cas核酸内切酶包括与SEQ ID NO：1-3470中的任一者或其变体具有至少75％序列同一性的核酸内切酶。 3.根据权利要求1所述的方法，其中所述2类V型Cas核酸内切酶包括与SEQ ID NO：141、215、229、261或1711-1722中的任一者或其变体具有至少75％序列同一性的核酸内切酶。 4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述工程化向导RNA包括与SEQ IDNO：3471、3539、3551-3559、3608-3609、3612、3636-3637、3640-3641、3644-3645、3648-3649、3652-3653、3656-3657、3660-3661、3664-3667、3671-3672、3678、3695-3696、3729-3730、3734-3735、3851-3857和6033-6036中的任一者的非简并核苷酸具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的序列。 5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述向导RNA包括与SEQ ID NO：3609的非简并核苷酸具有至少80％序列同一性的序列。 6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述工程化向导RNA被配置成与具有与SEQ ID NO：4466、4467、4468、4479、4484、4490、4492、4493、4495、4498中的任一者具有至少80％同一性的至少20-22个连续核苷酸的序列杂交。 7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述工程化向导RNA包括与SEQ IDNO：4428、4429、4430、4436、4441、4446、4452、4454、4455、4460或4461中的任一者具有至少80％同一性的核苷酸序列。 8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述细胞是真核细胞、T细胞、造血干细胞或其前体。 9.一种破坏细胞中的TIGIT基因座的方法，所述方法包括向所述细胞中引入： (a)2类V型Cas核酸内切酶；以及 (b)工程化向导RNA，其中所述工程化向导RNA被配置成与所述核酸内切酶形成复合物，并且所述工程化向导RNA包括被配置成与所述TIGIT基因座的区杂交的间隔子序列， 其中所述工程化向导RNA被配置成与具有与SEQ ID NO：4521-4537中的任一者具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的至少20-22个连续核苷酸的序列杂交；或者 其中所述工程化向导RNA包括与SEQ ID NO：4504-4520中的任一者具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的核苷酸序列。 10.根据权利要求9所述的方法，其中所述2类V型Cas核酸内切酶包括与SEQ ID NO：1-3470中的任一者或其变体具有至少75％序列同一性的核酸内切酶。 11.根据权利要求9所述的方法，其中所述2类V型Cas核酸内切酶包括与SEQ ID NO：141、215、229、261或1711-1722中的任一者或其变体具有至少75％序列同一性的核酸内切酶。 12.根据权利要求9至11中任一项所述的方法，其中所述工程化向导RNA包括与SEQ IDNO：3471、3539、3551-3559、3608-3609、3612、3636-3637、3640-3641、3644-3645、3648-3649、3652-3653、3656-3657、3660-3661、3664-3667、3671-3672、3678、3695-3696、3729-3730、3734-3735、3851-3857和6033-6036中的任一者的非简并核苷酸具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的序列。 13.根据权利要求9至12中任一项所述的方法，其中所述向导RNA包括与SEQ ID NO：3609的非简并核苷酸具有至少80％序列同一性的序列。 14.根据权利要求9至13中任一项所述的方法，其中所述工程化向导RNA被配置成与具有与SEQ ID NO：4521、4527、4528、4535或4536中的任一者具有至少80％同一性的至少20-22个连续核苷酸的序列杂交。 15.根据权利要求9至13中任一项所述的方法，其中所述工程化向导RNA包括与SEQ IDNO：4504、4510、4511、4518或4519中的任一者具有至少80％同一性的核苷酸序列。 16.根据权利要求9至15中任一项所述的方法，其中所述细胞是真核细胞、T细胞、造血干细胞或其前体。 17.一种破坏细胞中的AAVS1基因座的方法，所述方法包括向所述细胞中引入： (a)2类V型Cas核酸内切酶；以及 (b)工程化向导RNA，其中所述工程化向导RNA被配置成与所述核酸内切酶形成复合物，并且所述工程化向导RNA包括被配置成与所述AAVS1基因座的区杂交的间隔子序列， 其中所述工程化向导RNA被配置成与具有与SEQ ID NO：4569-4599中的任一者具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的序列互补的至少20-22个连续核苷酸的序列杂交；或者 其中所述工程化向导RNA包括与SEQ ID NO：4538-4568中的任一者具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的核苷酸序列。 18.根据权利要求17所述的方法，其中所述2类V型Cas核酸内切酶包括与SEQ ID NO：1-3470中的任一者或其变体具有至少75％序列同一性的核酸内切酶。 19.根据权利要求18所述的方法，其中所述2类V型Cas核酸内切酶包括与SEQ ID NO：141、215、229、261或1711-1722中的任一者或其变体具有至少75％序列同一性的核酸内切酶。 20.根据权利要求17至19中任一项所述的方法，其中所述工程化向导RNA包括与SEQ IDNO：3471、3539、3551-3559、3608-3609、3612、3636-3637、3640-3641、3644-3645、3648-3649、3652-3653、3656-3657、3660-3661、3664-3667、3671-3672、3678、3695-3696、3729-3730、3734-3735、3851-3857、6033-6036中的任一者的非简并核苷酸具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的序列。 21.根据权利要求17至20中任一项所述的方法，其中所述向导RNA包括与SEQ ID NO：3609的非简并核苷酸具有至少80％序列同一性的序列。 22.根据权利要求17至21中任一项所述的方法，其中所述工程化向导RNA被配置成与具有与SEQ ID NO：4574、4577、4578、4579、4582、4584、4585、4586、4587、4589、4590、4591、4592、4593、4595、4596或4598中的任一者具有至少80％同一性的至少20-22个连续核苷酸的序列杂交。 23.根据权利要求17至21中任一项所述的方法，其中所述工程化向导RNA包括与SEQ IDNO：4543、4546、4547、4548、4551、4553、4554、4555、4556、4558、4559、4560、4561、4562、4565或4567中的任一者具有至少80％同一性的核苷酸序列。 24.根据权利要求17至23中任一项所述的方法，其中所述细胞是真核细胞、T细胞、造血干细胞、肝细胞或其前体。 25.一种破坏细胞中的B2M基因座的方法，所述方法包括向所述细胞中引入： (a)2类V型Cas核酸内切酶；以及 (b)工程化向导RNA，其中所述工程化向导RNA被配置成与所述核酸内切酶形成复合物，并且所述工程化向导RNA包括被配置成与所述B2M基因座的区杂交的间隔子序列， 其中所述工程化向导RNA被配置成与具有与SEQ ID NO：4676-4751中的任一者具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的序列互补的至少20-22个连续核苷酸的序列杂交；或者 其中所述工程化向导RNA包括与SEQ ID NO：4600-4675中的任一者具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的核苷酸序列。 26.根据权利要求25所述的方法，其中所述2类V型Cas核酸内切酶包括与SEQ ID NO：1-3470中的任一者或其变体具有至少75％序列同一性的核酸内切酶。 27.根据权利要求26所述的方法，其中所述2类V型Cas核酸内切酶包括与SEQ ID NO：141、215、229、261或1711-1722中的任一者或其变体具有至少75％序列同一性的核酸内切酶。 28.根据权利要求25至27中任一项所述的方法，其中所述工程化向导RNA包括与SEQ IDNO：3471、3539、3551-3559、3608-3609、3612、3636-3637、3640-3641、3644-3645、3648-3649、3652-3653、3656-3657、3660-3661、3664-3667、3671-3672、3678、3695-3696、3729-3730、3734-3735、3851-3857和6033-6036中的任一者的非简并核苷酸具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的序列。 29.根据权利要求25至28中任一项所述的方法，其中所述向导RNA包括与SEQ ID NO：3609的非简并核苷酸具有至少80％序列同一性的序列。 30.根据权利要求25至29中任一项所述的方法，其中所述工程化向导RNA被配置成与具有与SEQ ID NO：4676、4678-4687、4690、4692、4698-4707、4720-4723、4725-4726、4732-4733、4736-4737、4741或4750-4751中的任一者具有至少80％同一性的至少20-22个连续核苷酸的序列杂交。 31.根据权利要求25至30中任一项所述的方法，其中所述工程化向导RNA包括与SEQ IDNO：4600、4602-4611、4614、4616、4622-4631、4644-4647、4649-4650、4656-4657、4660-4661、4665或4674-4675中的任一者具有至少80％同一性的核苷酸序列。 32.根据权利要求25至31中任一项所述的方法，其中所述细胞是真核细胞、T细胞、造血干细胞或其前体。 33.一种破坏细胞中的CD2基因座的方法，所述方法包括向所述细胞中引入： (a)2类V型Cas核酸内切酶；以及 (b)工程化向导RNA，其中所述工程化向导RNA被配置成与所述核酸内切酶形成复合物，并且所述工程化向导RNA包括被配置成与所述CD2基因座的区杂交的间隔子序列， 其中所述工程化向导RNA被配置成与具有与SEQ ID NO：4837-4921中的任一者具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的序列互补的至少20-22个连续核苷酸的序列杂交；或者 其中所述工程化向导RNA包括与SEQ ID NO：4752-4836中的任一者具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的核苷酸序列。 34.根据权利要求33所述的方法，其中所述2类V型Cas核酸内切酶包括与SEQ ID NO：1-3470中的任一者或其变体具有至少75％序列同一性的核酸内切酶。 35.根据权利要求34所述的方法，其中所述2类V型Cas核酸内切酶包括与SEQ ID NO：141、215、229、261或1711-1722中的任一者或其变体具有至少75％序列同一性的核酸内切酶。 36.根据权利要求33至35中任一项所述的方法，其中所述工程化向导RNA包括与SEQ IDNO：3471、3539、3551-3559、3608-3609、3612、3636-3637、3640-3641、3644-3645、3648-3649、3652-3653、3656-3657、3660-3661、3664-3667、3671-3672、3678、3695-3696、3729-3730、3734-3735、3851-3857和6033-6036中的任一者的非简并核苷酸具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的序列。 37.根据权利要求36所述的方法，其中所述向导RNA包括与SEQ ID NO：3609的非简并核苷酸具有至少80％序列同一性的序列。 38.根据权利要求33至37中任一项所述的方法，其中所述工程化向导RNA被配置成与具有与SEQ ID NO：4837、4844、4845、4848、4857-4858、4883、4887、4892-4893、4904-4909、4914、4916或4918中的任一者具有至少80％同一性的至少20-22个连续核苷酸的序列杂交。 39.根据权利要求38所述的方法，其中所述工程化向导RNA与来自表14E的靶向SEQ IDNO：4837、4844、4845、4848、4857-4858、4883、4887、4892-4893、4904-4909、4914、4916或4918中的任一者的向导RNA中的任一者具有至少80％序列同一性。 40.根据权利要求33至39中任一项所述的方法，其中所述细胞是真核细胞、T细胞、造血干细胞或其前体。 41.一种破坏细胞中的CD5基因座的方法，所述方法包括向所述细胞中引入： (a)2类V型Cas核酸内切酶；以及 (b)工程化向导RNA，其中所述工程化向导RNA被配置成与所述核酸内切酶形成复合物，并且所述工程化向导RNA包括被配置成与所述CD5基因座的区杂交的间隔子序列， 其中所述工程化向导RNA被配置成与具有与SEQ ID NO：4946-4969中的任一者具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的序列互补的至少20-22个连续核苷酸的序列杂交；或者 其中所述工程化向导RNA包括与SEQ ID NO：4922-4945中的任一者具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的核苷酸序列。 42.根据权利要求41所述的方法，其中所述2类V型Cas核酸内切酶包括与SEQ ID NO：1-3470中的任一者或其变体具有至少75％序列同一性的核酸内切酶。 43.根据权利要求42所述的方法，其中所述2类V型Cas核酸内切酶包括与SEQ ID NO：141、215、229、261或1711-1722中的任一者或其变体具有至少75％序列同一性的核酸内切酶。 44.根据权利要求41至43中任一项所述的方法，其中所述工程化向导RNA包括与SEQ IDNO：3471、3539、3551-3559、3608-3609、3612、3636-3637、3640-3641、3644-3645、3648-3649、3652-3653、3656-3657、3660-3661、3664-3667、3671-3672、3678、3695-3696、3729-3730、3734-3735、3851-3857和6033-6036中的任一者的非简并核苷酸具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的序列。 45.根据权利要求44所述的方法，其中所述向导RNA包括与SEQ ID NO：3609的非简并核苷酸具有至少80％序列同一性的序列。 46.根据权利要求41至45中任一项所述的方法，其中所述工程化向导RNA被配置成与具有与SEQ ID NO：4946-4947、4949、4951、4957-4960、4963、4967或4969中的任一者具有至少80％同一性的至少20-22个连续核苷酸的序列杂交。 47.根据权利要求41至45中任一项所述的方法，其中所述工程化向导RNA与来自表14F的靶向SEQ ID NO：4946-4947、4949、4951、4957-4960、4963、4967或4969中的任一者的向导RNA中的任一者具有至少80％序列同一性。 48.根据权利要求41至47中任一项所述的方法，其中所述细胞是真核细胞、T细胞、造血干细胞或其前体。 49.一种破坏细胞中的小鼠TRAC基因座的方法，所述方法包括向所述细胞中引入： (a)2类V型Cas核酸内切酶；以及 (b)工程化向导RNA，其中所述工程化向导RNA被配置成与所述核酸内切酶形成复合物，并且所述工程化向导RNA包括被配置成与所述小鼠TRAC基因座的区杂交的间隔子序列， 其中所述工程化向导RNA被配置成与具有与SEQ ID NO：5126-5195、5682或5684中的任一者具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的序列互补的至少20-22个连续核苷酸的序列杂交；或者 其中所述工程化向导RNA包括与SEQ ID NO：5056-5125、5681或5683中的任一者具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的核苷酸序列。 50.根据权利要求49所述的方法，其中所述2类V型Cas核酸内切酶包括与SEQ ID NO：1-3470中的任一者或其变体具有至少75％序列同一性的核酸内切酶。 51.根据权利要求50所述的方法，其中所述2类V型Cas核酸内切酶包括与SEQ ID NO：141、215、229、261或1711-1722中的任一者或其变体具有至少75％序列同一性的核酸内切酶。 52.根据权利要求49至51中任一项所述的方法，其中所述工程化向导RNA包括与SEQ IDNO：3471、3539、3551-3559、3608-3609、3612、3636-3637、3640-3641、3644-3645、3648-3649、3652-3653、3656-3657、3660-3661、3664-3667、3671-3672、3677-3678、3695-3696、3729-3730、3734-3735、3851-3857或6033-6036中的任一者的非简并核苷酸具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的序列。 53.根据权利要求52所述的方法，其中所述向导RNA包括与SEQ ID NO：3609的非简并核苷酸具有至少80％序列同一性的序列。 54.根据权利要求49至53中任一项所述的方法，其中所述工程化向导RNA被配置成与具有与SEQ ID NO：5126-5130、5133-5143、5147-5150、5172-5173、5184-5189或5192-5194中的任一者具有至少80％同一性的至少20-22个连续核苷酸的序列杂交。 55.根据权利要求49至53中任一项所述的方法，其中所述工程化向导RNA与来自表14G的靶向SEQ ID NO：5126-5130、5133-5143、5147-5150、5172-5173、5184-5189或5192-5194中的任一者的向导RNA中的任一者具有至少80％序列同一性。 56.根据权利要求49至55中任一项所述的方法，其中所述细胞是真核细胞、T细胞、造血干细胞或其前体。 57.一种破坏细胞中的小鼠TRBC1或TRBC2基因座的方法，所述方法包括向所述细胞中引入： (a)2类V型Cas核酸内切酶；以及 (b)工程化向导RNA，其中所述工程化向导RNA被配置成与所述核酸内切酶形成复合物，并且所述工程化向导RNA包括被配置成与所述小鼠TRBC1或TRBC2基因座的区杂交的间隔子序列， 其中所述工程化向导RNA被配置成与具有与SEQ ID NO：5211-5225或5247-5267中的任一者具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的序列互补的至少20-22个连续核苷酸的序列杂交；或者 其中所述工程化向导RNA包括与SEQ ID NO：5196-5210或5226-5246中的任一者具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的核苷酸序列。 58.根据权利要求57所述的方法，其中所述2类V型Cas核酸内切酶包括与SEQ ID NO：1-3470中的任一者或其变体具有至少75％序列同一性的核酸内切酶。 59.根据权利要求58所述的方法，其中所述2类V型Cas核酸内切酶包括与SEQ ID NO：141、215、229、261或1711-1722中的任一者或其变体具有至少75％序列同一性的核酸内切酶。 60.根据权利要求57至59中任一项所述的方法，其中所述工程化向导RNA包括与SEQ IDNO：3471、3539、3551-3559、3608-3609、3612、3636-3637、3640-3641、3644-3645、3648-3649、3652-3653、3656-3657、3660-3661、3664-3667、3671-3672、3677-3678、3695-3696、3729-3730、3734-3735、3851-3857或6033-6036中的任一者的非简并核苷酸具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的序列。 61.根据权利要求57至60中任一项所述的方法，其中所述向导RNA包括与SEQ ID NO：3609的非简并核苷酸具有至少80％序列同一性的序列。 62.根据权利要求57至61中任一项所述的方法，其中所述工程化向导RNA被配置成与具有与SEQ ID NO：5211、5213-5215、5217、5221、5223、5247、5249-5250、5252-5253、5258-5259或5264中的任一者具有至少80％同一性的至少20-22个连续核苷酸的序列杂交。 63.根据权利要求57至61中任一项所述的方法，其中所述工程化向导RNA与来自表14H的靶向SEQ ID NO：5211、5213-5215、5217、5221、5223、5247、5249-5250、5252-5253、5258-5259或5264中的任一者的向导RNA中的任一者具有至少80％序列同一性。 64.根据权利要求57至63中任一项所述的方法，其中所述细胞是真核细胞、T细胞、造血干细胞或其前体。 65.一种破坏细胞中的人TRBC1或TRBC2基因座的方法，所述方法包括向所述细胞中引入： (a)2类V型Cas核酸内切酶；以及 (b)工程化向导RNA，其中所述工程化向导RNA被配置成与所述核酸内切酶形成复合物，并且所述工程化向导RNA包括被配置成与所述人TRBC1或TRBC2基因座的区杂交的间隔子序列， 其中所述工程化向导RNA被配置成与具有与SEQ ID NO：5661-5679中的任一者具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的序列互补的至少20-22个连续核苷酸的序列杂交；或者 其中所述工程化向导RNA包括与SEQ ID NO：5642-5660中的任一者具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的核苷酸序列。 66.根据权利要求65所述的方法，其中所述2类V型Cas核酸内切酶包括与SEQ ID NO：1-3470中的任一者或其变体具有至少75％序列同一性的核酸内切酶。 67.根据权利要求66所述的方法，其中所述2类V型Cas核酸内切酶包括与SEQ ID NO：141、215、229、261或1711-1722中的任一者或其变体具有至少75％序列同一性的核酸内切酶。 68.根据权利要求65至67中任一项所述的方法，其中所述工程化向导RNA包括与SEQ IDNO：3471、3539、3551-3559、3608-3609、3612、3636-3637、3640-3641、3644-3645、3648-3649、3652-3653、3656-3657、3660-3661、3664-3667、3671-3672、3678、3695-3696、3729-3730、3734-3735、3851-3857或6033-6036中的任一者的非简并核苷酸具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的序列。 69.根据权利要求65至68中任一项所述的方法，其中所述向导RNA包括与SEQ ID NO：3609的非简并核苷酸具有至少80％序列同一性的序列。 70.根据权利要求65至69中任一项所述的方法，其中所述工程化向导RNA被配置成与具有与SEQ ID NO：5661-5663、5672-5675或5678中的任一者具有至少80％同一性的至少20-22个连续核苷酸的序列杂交。 71.根据权利要求65至69中任一项所述的方法，其中所述工程化向导RNA与来自表14I的靶向SEQ ID NO：5661-5663、5672-5675或5678中的任一者的向导RNA中的任一者具有至少80％序列同一性。 72.根据权利要求65至71中任一项所述的方法，其中所述细胞是真核细胞、T细胞、造血干细胞或其前体。 73.一种破坏细胞中的HPRT基因座的方法，所述方法包括向所述细胞中引入： (a)2类V型Cas核酸内切酶；以及 (b)工程化向导RNA，其中所述工程化向导RNA被配置成与所述核酸内切酶形成复合物，并且所述工程化向导RNA包括被配置成与所述HPRT基因座的区杂交的间隔子序列， 其中所述工程化向导RNA被配置成与具有与SEQ ID NO：5562-5641中的任一者具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的序列互补的至少20-22个连续核苷酸的序列杂交；或者 其中所述工程化向导RNA包括与SEQ ID NO：5482-5561中的任一者具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的核苷酸序列。 74.根据权利要求73所述的方法，其中所述2类V型Cas核酸内切酶包括与SEQ ID NO：1-3470中的任一者或其变体具有至少75％序列同一性的核酸内切酶。 75.根据权利要求74所述的方法，其中所述2类V型Cas核酸内切酶包括与SEQ ID NO：141、215、229、261或1711-1722中的任一者或其变体具有至少75％序列同一性的核酸内切酶。 76.根据权利要求73至75中任一项所述的方法，其中所述工程化向导RNA包括与SEQ IDNO：3471、3539、3551-3559、3608-3609、3612、3636-3637、3640-3641、3644-3645、3648-3649、3652-3653、3656-3657、3660-3661、3664-3667、3671-3672、3678、3695-3696、3729-3730、3734-3735、3851-3857或6033-6036中的任一者的非简并核苷酸具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的序列。 77.根据权利要求73至76中任一项所述的方法，其中所述向导RNA包括与SEQ ID NO：3609的非简并核苷酸具有至少80％序列同一性的序列。 78.根据权利要求73至77中任一项所述的方法，其中所述工程化向导RNA被配置成与具有与SEQ ID NO：5562-5564或5568中的任一者具有至少80％同一性的至少20-22个连续核苷酸的序列杂交。 79.根据权利要求73至77中任一项所述的方法，其中所述工程化向导RNA与来自表14J的靶向SEQ ID NO：5562-5564或5568中的任一者的向导RNA中的任一者具有至少80％序列同一性。 80.根据权利要求73至80中任一项所述的方法，其中所述细胞是真核细胞、肝细胞、T细胞、造血干细胞或其前体。 81.一种破坏细胞中的APO-A1基因座的方法，所述方法包括向所述细胞中引入： (a)2类V型Cas核酸内切酶；以及 (b)工程化向导RNA，其中所述工程化向导RNA被配置成与所述核酸内切酶形成复合物，并且所述工程化向导RNA包括被配置成与所述APO-A1基因座的区杂交的间隔子序列， 其中所述工程化向导RNA被配置成与具有与SEQ ID NO：5861-5874中的任一者具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的序列互补的至少20-22个连续核苷酸的序列杂交；或者 其中所述工程化向导RNA包括与SEQ ID NO：5847-5860中的任一者具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的核苷酸序列。 82.根据权利要求81所述的方法，其中所述2类V型Cas核酸内切酶包括与SEQ ID NO：1-3470中的任一者或其变体具有至少75％序列同一性的核酸内切酶。 83.根据权利要求82所述的方法，其中所述2类V型Cas核酸内切酶包括与SEQ ID NO：141、215、229、261或1711-1722中的任一者或其变体具有至少75％序列同一性的核酸内切酶。 84.根据权利要求81至83中任一项所述的方法，其中所述工程化向导RNA包括与SEQ IDNO：3471、3539、3551-3559、3608-3609、3612、3636-3637、3640-3641、3644-3645、3648-3649、3652-3653、3656-3657、3660-3661、3664-3667、3671-3672、3678、3695-3696、3729-3730、3734-3735、3851-3857或6033-6036中的任一者的非简并核苷酸具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的序列。 85.根据权利要求81至84中任一项所述的方法，其中所述向导RNA包括与SEQ ID NO：3609的非简并核苷酸具有至少80％序列同一性的序列。 86.根据权利要求81至85中任一项所述的方法，其中所述工程化向导RNA被配置成与具有与SEQ ID NO：5861-5866或5868-5869中的任一者具有至少80％同一性的至少20-22个连续核苷酸的序列杂交。 87.根据权利要求81至85中任一项所述的方法，其中所述工程化向导RNA与来自表43A的靶向SEQ ID NO：5861-5866或5868-5869中的任一者的向导RNA中的任一者具有至少80％序列同一性。 88.根据权利要求81至87中任一项所述的方法，其中所述细胞是真核细胞、肝细胞、T细胞、造血干细胞或其前体。 89.一种破坏细胞中的ANGPTL3基因座的方法，所述方法包括向所述细胞中引入： (a)2类V型Cas核酸内切酶；以及 (b)工程化向导RNA，其中所述工程化向导RNA被配置成与所述核酸内切酶形成复合物，并且所述工程化向导RNA包括被配置成与所述ANGPTL3基因座的区杂交的间隔子序列， 其中所述工程化向导RNA被配置成与具有与SEQ ID NO：5953-6030中的任一者具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的序列互补的至少20-22个连续核苷酸的序列杂交；或者 其中所述工程化向导RNA包括与SEQ ID NO：5875-5952中的任一者具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的核苷酸序列。 90.根据权利要求89所述的方法，其中所述2类V型Cas核酸内切酶包括与SEQ ID NO：1-3470中的任一者或其变体具有至少75％序列同一性的核酸内切酶。 91.根据权利要求90所述的方法，其中所述2类V型Cas核酸内切酶包括与SEQ ID NO：141、215、229、261或1711-1722中的任一者或其变体具有至少75％序列同一性的核酸内切酶。 92.根据权利要求89至91中任一项所述的方法，其中所述工程化向导RNA包括与SEQ IDNO：3471、3539、3551-3559、3608-3609、3612、3636-3637、3640-3641、3644-3645、3648-3649、3652-3653、3656-3657、3660-3661、3664-3667、3671-3672、3678、3695-3696、3729-3730、3734-3735、3851-3857或6033-6036中的任一者的非简并核苷酸具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的序列。 93.根据权利要求89至92中任一项所述的方法，其中所述向导RNA包括与SEQ ID NO：3609的非简并核苷酸具有至少80％序列同一性的序列。 94.根据权利要求89至93中任一项所述的方法，其中所述工程化向导RNA被配置成与具有与SEQ ID NO：5955-5963、5968-5975、5979-5987、5989-5993、5997、5999、6003-6010、6014-6016、6024-6025或6027-6030中的任一者具有至少80％同一性的至少20-22个连续核苷酸的序列杂交。 95.根据权利要求89至93中任一项所述的方法，其中所述工程化向导RNA与来自表43B的靶向SEQ ID NO：5955-5963、5968-5975、5979-5987、5989-5993、5997、5999、6003-6010、6014-6016、6024-6025或6027-6030中的任一者的向导RNA中的任一者具有至少80％序列同一性。 96.根据权利要求89至95中任一项所述的方法，其中所述细胞是真核细胞、肝细胞、T细胞、造血干细胞或其前体。 97.一种破坏细胞中的人Rosa26基因座的方法，所述方法包括向所述细胞中引入： (a)2类V型Cas核酸内切酶；以及 (b)工程化向导RNA，其中所述工程化向导RNA被配置成与所述核酸内切酶形成复合物，并且所述工程化向导RNA包括被配置成与所述人Rosa26基因座的区杂交的间隔子序列， 其中所述工程化向导RNA被配置成与具有与SEQ ID NO：5013-5055中的任一者具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的序列互补的至少20-22个连续核苷酸的序列杂交；或者 其中所述工程化向导RNA包括与SEQ ID NO：4970-5012中的任一者具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的核苷酸序列。 98.根据权利要求97所述的方法，其中所述2类V型Cas核酸内切酶包括与SEQ ID NO：1-3470中的任一者或其变体具有至少75％序列同一性的核酸内切酶。 99.根据权利要求98所述的方法，其中所述2类V型Cas核酸内切酶包括与SEQ ID NO：141、215、229、261或1711-1722中的任一者或其变体具有至少75％序列同一性的核酸内切酶。 100.根据权利要求97至99中任一项所述的方法，其中所述工程化向导RNA包括与SEQID NO：3471、3539、3551-3559、3608-3609、3612、3636-3637、3640-3641、3644-3645、3648-3649、3652-3653、3656-3657、3660-3661、3664-3667、3671-3672、3678、3695-3696、3729-3730、3734-3735、3851-3857或6033-6036中的任一者的非简并核苷酸具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的序列。 101.根据权利要求97至100中任一项所述的方法，其中所述向导RNA包括与SEQ ID NO：3609的非简并核苷酸具有至少80％序列同一性的序列。 102.根据权利要求97至101中任一项所述的方法，其中所述细胞是真核细胞、肝细胞、T细胞、造血干细胞或其前体。 103.一种破坏细胞中的FAS基因座的方法，所述方法包括向所述细胞中引入： (a)2类V型Cas核酸内切酶；以及 (b)工程化向导RNA，其中所述工程化向导RNA被配置成与所述核酸内切酶形成复合物，并且所述工程化向导RNA包括被配置成与所述FAS基因座的区杂交的间隔子序列， 其中所述工程化向导RNA被配置成与具有与SEQ ID NO：5367-5465中的任一者具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的序列互补的至少20-22个连续核苷酸的序列杂交；或者 其中所述工程化向导RNA包括与SEQ ID NO：5268-5366中的任一者具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的核苷酸序列。 104.根据权利要求103所述的方法，其中所述2类V型Cas核酸内切酶包括与SEQ ID NO：1-3470中的任一者或其变体具有至少75％序列同一性的核酸内切酶。 105.根据权利要求104所述的方法，其中所述2类V型Cas核酸内切酶包括与SEQ ID NO：141、215、229、261或1711-1722中的任一者或其变体具有至少75％序列同一性的核酸内切酶。 106.根据权利要求103至105中任一项所述的方法，其中所述工程化向导RNA包括与SEQID NO：3471、3539、3551-3559、3608-3609、3612、3636-3637、3640-3641、3644-3645、3648-3649、3652-3653、3656-3657、3660-3661、3664-3667、3671-3672、3678、3695-3696、3729-3730、3734-3735、3851-3857或6033-6036中的任一者的非简并核苷酸具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的序列。 107.根据权利要求103至106中任一项所述的方法，其中所述向导RNA包括与SEQ IDNO：3609的非简并核苷酸具有至少80％序列同一性的序列。 108.根据权利要求103至107中任一项所述的方法，其中所述细胞是真核细胞、肝细胞、T细胞、造血干细胞或其前体。 109.一种破坏细胞中的PD-1基因座的方法，所述方法包括向所述细胞中引入： (a)2类V型Cas核酸内切酶；以及 (b)工程化向导RNA，其中所述工程化向导RNA被配置成与所述核酸内切酶形成复合物，并且所述工程化向导RNA包括被配置成与所述PD-1基因座的区杂交的间隔子序列， 其中所述工程化向导RNA被配置成与具有与SEQ ID NO：5474-5481中的任一者具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的序列互补的至少20-22个连续核苷酸的序列杂交；或者 其中所述工程化向导RNA包括与SEQ ID NO：5466-5473中的任一者具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的核苷酸序列。 110.根据权利要求109所述的方法，其中所述2类V型Cas核酸内切酶包括与SEQ ID NO：1-3470中的任一者或其变体具有至少75％序列同一性的核酸内切酶。 111.根据权利要求110所述的方法，其中所述2类V型Cas核酸内切酶包括与SEQ ID NO：141、215、229、261或1711-1722中的任一者或其变体具有至少75％序列同一性的核酸内切酶。 112.根据权利要求109至111中任一项所述的方法，其中所述工程化向导RNA包括与SEQID NO：3471、3539、3551-3559、3608-3609、3612、3636-3637、3640-3641、3644-3645、3648-3649、3652-3653、3656-3657、3660-3661、3664-3667、3671-3672、3678、3695-3696、3729-3730、3734-3735、3851-3857或6033-6036中的任一者的非简并核苷酸具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的序列。 113.根据权利要求109至112中任一项所述的方法，其中所述向导RNA包括与SEQ IDNO：3609的非简并核苷酸具有至少80％序列同一性的序列。 114.根据权利要求109至113中任一项所述的方法，其中所述细胞是真核细胞、肝细胞、T细胞、造血干细胞或其前体。 115.一种工程化核酸酶系统，其包括： (a)核酸内切酶，所述核酸内切酶与SEQ ID NO：215中的任一者或其变体具有至少75％序列同一性；以及 (b)工程化向导RNA，其中所述工程化向导RNA被配置成与所述核酸内切酶形成复合物，并且所述工程化向导RNA包括被配置成与靶核酸序列杂交的间隔子序列， 其中与包括Cas9酶的等效系统相比，当向人类受试者施用时，所述系统具有降低的免疫原性。 116.根据权利要求115所述的系统，其中所述Cas9酶是SpCas9酶。 117.根据权利要求115至116所述的系统，其中所述向导RNA包括与SEQ ID NO：3609的非简并核苷酸具有至少80％序列同一性的序列。 118.根据权利要求115至117中任一项所述的系统，其中所述免疫原性是抗体免疫原性。 119.一种破坏细胞中的小鼠HAO-1基因座的方法，所述方法包括向所述细胞中引入： (a)2类V型Cas核酸内切酶；以及 (b)工程化向导RNA，其中所述工程化向导RNA被配置成与所述核酸内切酶形成复合物，并且所述工程化向导RNA包括被配置成与所述小鼠HAO-1基因座的区杂交的间隔子序列， 其中所述工程化向导RNA包括来自表25的包括表25中所描述的核苷酸修饰的向导RNAmH29-1_37、mH29-15_37、mH29-29_37的核苷酸； 或者其中所述工程化向导RNA包括SEQ ID NO：4184-4225中的任一者。 120.根据权利要求119所述的方法，其中所述2类V型Cas核酸内切酶包括与SEQ ID NO：1-3470中的任一者或其变体具有至少75％序列同一性的核酸内切酶。 121.根据权利要求120所述的方法，其中所述2类V型Cas核酸内切酶包括与SEQ ID NO：141、215、229、261或1711-1722中的任一者或其变体具有至少75％序列同一性的核酸内切酶。 122.根据权利要求119至121中任一项所述的方法，其中所述工程化向导RNA包括与SEQID NO：3471、3539、3551-3559、3608-3609、3612、3636-3637、3640-3641、3644-3645、3648-3649、3652-3653、3656-3657、3660-3661、3664-3667、3671-3672、3678、3695-3696、3729-3730、3734-3735、3851-3857或6033-6036中的任一者的非简并核苷酸具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的序列。 123.根据权利要求119至122中任一项所述的方法，其中所述向导RNA包括与SEQ IDNO：3609的非简并核苷酸具有至少80％序列同一性的序列。 124.根据权利要求119至123中任一项所述的方法，其中所述细胞是真核细胞、肝细胞、T细胞、造血干细胞或其前体。 125.根据权利要求119至124中任一项所述的方法，其中所述工程化向导RNA包括来自表25的包括表25中所描述的核苷酸修饰的向导RNA mH29-15_37或mH29-29_37的核苷酸。 126.根据权利要求119至125中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括破坏来自所述HAO-1基因座的乙醇酸氧化酶的表达。 127.一种破坏细胞中的人TRAC基因座的方法，所述方法包括向所述细胞中引入： (a)2类V型Cas核酸内切酶；以及 (b)工程化向导RNA，其中所述工程化向导RNA被配置成与所述核酸内切酶形成复合物，并且所述工程化向导RNA包括被配置成与所述人TRAC基因座的区杂交的间隔子序列， 其中所述工程化向导RNA包括来自表28B的包括表28B中所描述的核苷酸修饰的MG29-1-TRAC-sgRNA-35的核苷酸。 128.根据权利要求127所述的方法，其中所述2类V型Cas核酸内切酶包括与SEQ ID NO：1-3470中的任一者或其变体具有至少75％序列同一性的核酸内切酶。 129.根据权利要求128所述的方法，其中所述2类V型Cas核酸内切酶包括与SEQ ID NO：141、215、229、261或1711-1722中的任一者或其变体具有至少75％序列同一性的核酸内切酶。 130.根据权利要求127至129中任一项所述的方法，其中所述工程化向导RNA包括与SEQID NO：3471、3539、3551-3559、3608-3609、3612、3636-3637、3640-3641、3644-3645、3648-3649、3652-3653、3656-3657、3660-3661、3664-3667、3671-3672、3678、3695-3696、3729-3730、3734-3735、3851-3857或6033-6036中的任一者的非简并核苷酸具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的序列。 131.根据权利要求127至130中任一项所述的方法，其中所述向导RNA包括与SEQ IDNO：3609的非简并核苷酸具有至少80％序列同一性的序列。 132.根据权利要求127至131中任一项所述的方法，其中所述细胞是真核细胞、肝细胞、T细胞、造血干细胞或其前体。 133.一种破坏细胞中的白蛋白基因座的方法，所述方法包括向所述细胞中引入： (a)2类V型Cas核酸内切酶；以及 (b)工程化向导RNA，其中所述工程化向导RNA被配置成与所述核酸内切酶形成复合物，并且所述工程化向导RNA包括被配置成与所述白蛋白基因座的区杂交的间隔子序列， 其中所述工程化向导RNA包括来自表29的包括表29中所描述的核苷酸修饰的mAlb298-37、mAlb2912-37、mAlb2918-37或mAlb298-34的核苷酸；或者 其中所述工程化向导RNA包括包含表46中所描述的核苷酸修饰的mAlb29-8-44、mAlb29-8-50、mAlb29-8-50b、mAlb29-8-51b、mAlb29-8-52b、mAlb29-8-53b或mAlb29-8-54b的核苷酸。 134.根据权利要求133所述的方法，其中所述2类V型Cas核酸内切酶包括与SEQ ID NO：1-3470中的任一者或其变体具有至少75％序列同一性的核酸内切酶。 135.根据权利要求134所述的方法，其中所述2类V型Cas核酸内切酶包括与SEQ ID NO：141、215、229、261或1711-1722中的任一者或其变体具有至少75％序列同一性的核酸内切酶。 136.根据权利要求133至135中任一项所述的方法，其中所述工程化向导RNA包括与SEQID NO：3471、3539、3551-3559、3608-3609、3612、3636-3637、3640-3641、3644-3645、3648-3649、3652-3653、3656-3657、3660-3661、3664-3667、3671-3672、3678、3695-3696、3729-3730、3734-3735、3851-3857或6033-6036中的任一者的非简并核苷酸具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的序列。 137.根据权利要求133至136中任一项所述的方法，其中所述向导RNA包括与SEQ IDNO：3609的非简并核苷酸具有至少80％序列同一性的序列。 138.根据权利要求133至137中任一项所述的方法，其中所述细胞是真核细胞、肝细胞、T细胞、造血干细胞或其前体。 139.根据权利要求133至138中任一项所述的方法，其中所述工程化向导RNA包括来自表29的包括表29中所描述的核苷酸修饰的mAlb298-37、mAlb2912-37、mAlb2918-37或mAlb298-34的核苷酸。 140.一种工程化向导RNA，其包括： a)DNA靶向区段，所述DNA靶向区段包括与靶DNA分子中的靶序列互补的核苷酸序列；以及 b)蛋白质结合区段，所述蛋白质结合区段被配置成与2类V型Cas核酸内切酶结合，并且 其中所述向导RNA包括表34中的SEQ ID NO：5695-5701中的任一者所描绘的核苷酸修饰模式。 141.根据权利要求140所述的工程化向导RNA，其中所述向导RNA包括mAlb29-8-44、mAlb29-8-50、mAlb29-8-37或mAlb29-12-44。 142.根据权利要求140所述的工程化向导RNA，其中所述向导RNA包括hH29-4_50、hH29-21_50、hH29-23_50、hH29-41_50、hH29-4_50b、hH29-21_50b、hH29-23_50b或hH29-41_50b、mH29-1-50、mH29-15-50、mH29-29-50、mH29-1-50b、mH29-15-50b或mH29-29-50b。 143.根据权利要求140所述的工程化向导RNA，其中所述DNA靶向区段被配置成与HAO-1基因或白蛋白基因杂交。 144.根据权利要求140至142中任一项所述的工程化向导RNA，其中所述2类V型Cas核酸内切酶包括与SEQ ID NO：141、215、229、261或1711-1722中的任一者或其变体具有至少75％序列同一性的核酸内切酶。 145.根据权利要求140至144中任一项所述的工程化向导RNA，其中所述2类V型Cas核酸内切酶包括与SEQ ID NO：215具有至少75％序列同一性的核酸内切酶。 146.一种工程化核酸酶系统，其包括： (a)核酸内切酶，所述核酸内切酶与SEQ ID NO：1-3470中的任一者或其变体或编码所述核酸内切酶的核苷酸序列具有至少75％序列同一性；以及 (b)编码CRISPR阵列的多核苷酸序列，其中所述CRISPR阵列被配置成由所述核酸内切酶处理成工程化向导RNA，其中所述工程化向导RNA被配置成与所述核酸内切酶形成复合物，并且所述工程化向导RNA包括被配置成与靶核酸序列杂交的间隔子序列， 其中所述间隔子序列被配置成与白蛋白基因杂交。 147.根据权利要求146所述的系统，其中所述多核苷酸序列包括与SEQ ID NO：5712具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的序列。 148.根据权利要求146或147所述的系统，其中所述核酸内切酶包括与SEQ ID NO：141、215、229、261或1711-1722中的任一者或其变体具有至少75％序列同一性的核酸内切酶。 149.根据权利要求148所述的系统，其中所述核酸内切酶包括与SEQ ID NO：215具有至少75％序列同一性的核酸内切酶。 150.一种工程化核酸酶系统，其包括： (a)核酸内切酶，所述核酸内切酶与SEQ ID NO：470或其变体具有至少75％序列同一性；以及 (b)工程化向导RNA，其中所述工程化向导RNA被配置成与所述核酸内切酶形成复合物，并且所述工程化向导RNA包括被配置成与靶核酸序列杂交的间隔子序列。 151.根据权利要求150所述的工程化核酸酶系统，其中所述工程化向导RNA包括与SEQID NO：6031具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的序列。 152.根据权利要求151或152所述的工程化核酸酶系统，其中所述核酸内切酶被配置成对包括SEQ ID NO：6032的5′PAM序列具有选择性。 153.一种工程化核酸酶系统，其包括： (a)核酸内切酶，所述核酸内切酶与SEQ ID NO：2824、2841或2896中的任一者或其变体具有至少至少约80％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性；以及 (b)工程化向导RNA，其中所述工程化向导RNA被配置成与所述核酸内切酶形成复合物，并且所述工程化向导RNA包括被配置成与靶核酸序列杂交的间隔子序列， 其中所述工程化向导RNA包括与SEQ ID NO：6033、6034或6035中的任一者具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的序列。 154.根据权利要求153所述的工程化核酸酶系统，其中所述核酸内切酶与SEQ ID NO：2824具有至少80％序列同一性，并且所述工程化向导RNA与SEQ ID NO：6033具有至少80％序列同一性。 155.根据权利要求153所述的工程化核酸酶系统，其中所述核酸内切酶与SEQ ID NO：2841具有至少80％序列同一性，并且所述工程化向导RNA与SEQ ID NO：6034具有至少80％序列同一性。 156.根据权利要求153所述的工程化核酸酶系统，其中所述核酸内切酶与SEQ ID NO：2896具有至少80％序列同一性，并且所述工程化向导RNA与SEQ ID NO：6035具有至少80％序列同一性。 157.根据权利要求153至156中任一项所述的工程化核酸酶系统，其中所述核酸内切酶被配置成对包括SEQ ID NO：6037-6039中的任一者的5′PAM序列具有选择性。 158.一种脂质纳米颗粒，其包括： (a)本文所描述的核酸内切酶中的任何核酸内切酶； (b)本文所描述的工程化向导RNA中的任何工程化向导RNA： (c)阳离子脂质； (d)固醇； (e)中性脂质；以及 (f)经PEG修饰的脂质。 159.根据权利要求158所述的脂质纳米颗粒，其中所述阳离子脂质包括C12-200，所述固醇包括胆固醇，所述中性脂质包括DOPE，或所述经PEG修饰的脂质包括DMG-PEG2000。 160.根据权利要求158所述的脂质纳米颗粒，其中所述阳离子脂质包括图109中所描绘的阳离子脂质中的任何阳离子脂质。