mRNA核苷酸帽的纯化和回收
本公开涉及从mRNA制备物中纯化和回收核苷酸信使RNA(mRNA)帽，其包括分离和纯化来自mRNA合成的过量核苷酸mRNA帽。
发明专利
CN202280039034.4
2022-03-31
CN117413059A
2024-01-16
C12N15/10(2006.01)
摩登纳特斯有限公司
J·博杜安;L·迪特;K·维克
美国马萨诸塞州
中国专利代理(香港)有限公司
李进%杨思捷
美国;US
1.一种从mRNA制备物中回收mRNA核苷酸帽或其盐的方法，所述方法包括： 收集并合并包含所述核苷酸mRNA帽或其盐和一种或多种污染物的一种或多种混合物；以及 从合并的混合物中去除所述污染物。 2.如权利要求1所述的方法，其中所述mRNA核苷酸帽或其盐是： 3.如权利要求1所述的方法，其中所述mRNA核苷酸帽或其盐是： 4.如权利要求1所述的方法，其中所述mRNA核苷酸帽或其盐是： 5.如权利要求3或4所述的方法，其中所述阳离子是铵。 6.如权利要求3或4所述的方法，其中所述阳离子是二甲基辛基铵、二甲基己基铵或三乙基铵。 7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述去除包括： 从包含所述mRNA核苷酸帽或其盐的所述合并的混合物中去除大分子和蛋白质，以提供第一混合物。 8.如权利要求7所述的方法，其中所述去除大分子和蛋白质包括过滤。 9.如权利要求8所述的方法，其中用于去除大分子和蛋白质的所述过滤是切向流过滤。 10.如权利要求8或9所述的方法，其中用于去除大分子和蛋白质的所述过滤包括盒式过滤器或螺旋卷式过滤器。 11.如权利要求8-10中任一项所述的方法，其中用于去除大分子和蛋白质的所述过滤包括基于纤维素的膜过滤器。 12.如权利要求8-10中任一项所述的方法，其中用于去除大分子和蛋白质的所述过滤包括聚酰胺薄膜复合过滤器。 13.如权利要求8-12中任一项所述的方法，其中用于去除大分子和蛋白质的所述过滤包括截留分子量为约5kDa至约15kDa的过滤器。 14.如权利要求7-13中任一项所述的方法，其中将pH调节至约6.0至约6.5。 15.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述去除进一步包括： 将所述第一混合物浓缩并脱盐以提供第二混合物。 16.如权利要求15所述的方法，其中所述脱盐包括过滤。 17.如权利要求16所述的方法，其中用于使所述第一混合物脱盐的所述过滤是切向流过滤。 18.如权利要求16或17所述的方法，其中用于使所述第一混合物脱盐的所述过滤包括盒式过滤器或螺旋卷式过滤器。 19.如权利要求16-18中任一项所述的方法，其中用于使所述第一混合物脱盐的所述过滤包括基于纤维素的膜过滤器。 20.如权利要求16-18中任一项所述的方法，其中用于使所述第一混合物脱盐的所述过滤包括聚酰胺薄膜复合过滤器。 21.如权利要求16-20中任一项所述的方法，其中用于使所述第一混合物脱盐的所述过滤包括截留分子量为约50Da至约5kDa的过滤器。 22.如权利要求16-20中任一项所述的方法，其中用于使所述第一混合物脱盐的所述过滤包括截留分子量为约2kDa的过滤器。 23.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述去除进一步包括： 从所述第二混合物中去除核苷三磷酸(NTP)并进行离子交换以提供第三混合物。 24.如权利要求23所述的方法，其中所述去除NTP包括使所述第二混合物通过离子交换色谱系统。 25.如权利要求23或24所述的方法，其中所述离子交换色谱系统是阴离子交换系统。 26.如权利要求25所述的方法，其中所述阴离子交换色谱系统包含流动相，所述流动相包括水、水溶液或缓冲水溶液。 27.如权利要求25或26所述的方法，其中所述流动相包括水和NaCl水溶液。 28.如权利要求27所述的方法，其中所述NaCl水溶液具有约0.25M至约2.0M的浓度。 29.如权利要求25或26所述的方法，其中所述流动相包括水和NH4Cl水溶液。 30.如权利要求29所述的方法，其中所述NH4Cl水溶液具有约0.5M至约1.5M的浓度。 31.如权利要求25-30中任一项所述的方法，其中所述阴离子交换色谱包括将N,N-二甲基辛基铵(DMOA)交换为NH4+。 32.如权利要求25-31中任一项所述的方法，其中所述阴离子交换色谱系统包括含有强碱或弱碱的固定相。 33.如权利要求32所述的方法，其中所述固定相包括官能团，所述官能团包含二甲胺、三乙胺、多胺、叔胺、季胺、二甲基乙醇胺或三甲基苄基铵。 34.如权利要求24-33中任一项所述的方法，其中所述离子交换色谱系统的泵流量是约50mL/min至约10L/min。 35.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述去除进一步包括： 将所述第三混合物浓缩并脱盐以提供第四混合物。 36.如权利要求35所述的方法，其中所述第三混合物的所述脱盐包括使所述第三混合物通过色谱系统或过滤或其组合。 37.如权利要求36所述的方法，其中用于使所述第三混合物脱盐的所述色谱系统是反相色谱。 38.如权利要求37所述的方法，其中所述反相色谱包括固定相，所述固定相包括聚(苯乙烯二乙烯基苯)或C18树脂。 39.如权利要求37或38所述的方法，其中所述反相色谱包括流动相，所述流动相包括DMOA缓冲溶液。 40.如权利要求39所述的方法，其中所述反相色谱的所述流动相的所述DMOA缓冲溶液具有约5mM至约15mM的浓度。 41.如权利要求37或38所述的方法，其中所述反相色谱包括流动相，所述流动相包括乙腈。 42.如权利要求37-41中任一项所述的方法，其中所述反相色谱进一步包括盐交换。 43.如权利要求37-42中任一项所述的方法，其中所述反相色谱包括将Na+交换为N,N-二甲基辛基铵(DMOA)。 44.如权利要求37-43中任一项所述的方法，其中所述反相色谱系统的泵流量是约50mL/min至约10L/min。 45.如权利要求36所述的方法，其中所述第三混合物的所述过滤是切向流过滤。 46.如权利要求36或45所述的方法，其中所述第三混合物的所述过滤包括盒式过滤器或螺旋卷式过滤器。 47.如权利要求36、45和46中任一项所述的方法，其中所述第三混合物的所述过滤包括基于纤维素的膜过滤器。 48.如权利要求36、45和46中任一项所述的方法，其中所述第三混合物的所述过滤包括聚酰胺薄膜复合过滤器。 49.如权利要求36和45-48中任一项所述的方法，其中所述第三混合物的所述过滤包括截留分子量为约50Da至约5kDa的过滤器。 50.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述去除进一步包括： 过滤所述第四混合物并调节所述第四混合物的浓度和pH。 51.如权利要求50所述的方法，所述方法包括通过聚乙二烯过滤器、聚乙烯过滤器、聚丙烯过滤器、聚四氟乙烯过滤器、纤维素酯过滤器或聚醚砜过滤器过滤所述第四混合物。 52.如权利要求50或51所述的方法，其中所述第四混合物的所述过滤包括使用尺寸为约0.1μm至约1μm的过滤器。 53.如权利要求50所述的方法，其中将所述第四混合物的浓度调节至约1000mM至约25mM。 54.如权利要求50所述的方法，其中将所述第四混合物的浓度调节至约100mM。 55.如权利要求50所述的方法，其中将所述第四混合物的浓度调节至约50mM。 56.如权利要求50和53-55中任一项所述的方法，其中用碱性溶液调节所述第四混合物的浓度。 57.如权利要求56所述的方法，其中用于调节所述第四混合物的浓度的所述碱性溶液包含NH4OH和水。 58.如权利要求56所述的方法，其中用于调节第四混合物的浓度的所述碱性溶液包含水中的约3.5％w/v至约4.5％w/v NH4OH。 59.如权利要求50和53-58中任一项所述的方法，其中将所述第四混合物的pH调节至约5.3至约7.3。