C-葡糖基转移酶变体及其用途
本发明涉及新型C‑葡糖基转移酶变体及其用途。与野生型C‑葡糖基转移酶相比，根据本发明的C‑葡糖基转移酶变体具有改善的糖苷键形成能力，因此可以增加聚酮基团和假天然产物，特别是I型、II型、III型聚酮、非核糖体肽、苯丙素类和其他芳香族天然产物的糖苷产生效果，因此可用于制备含有C‑糖苷化合物作为构成成分的药物、食品添加剂、营养补充剂等。
发明专利
CN202280016203.2
2022-01-27
CN117425727A
2024-01-19
C12N9/10(2006.01)
韩国科学技术院
李相烨;梁东秀;张宇旲
韩国大田市
北京坤瑞律师事务所
陈桉
韩国;KR
1.一种C-葡糖基转移酶变体，其包含选自由SEQ ID NO:1所示的C-葡糖基转移酶中的F17、V93、V132、Y193、L164和R322组成的组的至少一个氨基酸的突变。 2.根据权利要求1所述的C-葡糖基转移酶变体，其中，所述变体进一步包含选自由SEQID NO:1所示的C-葡糖基转移酶中的以下组成的组的至少一个氨基酸的突变：F17、V405、P107、L208、L164、P45、I305、L316、F401、Y94、N57、Y187、C16、P319、F167、V132、N206、R406、Q386、V129、L125、L194、I95、S215、L184、Y158、L29、L27、F202、H159、S370、H365、V329、M301、V315、V190、C366、W80、L58、Q210、F312、D61、I207、L363、P196、L106、V93、A394、W314、S155、P88、D99、Y284、E189、G49、H328、E399、T392、F387、A44、P199、E46、R28、V285、I124、R419、L306、Y157、Y200、E373、P191、L214、S376、V15、E332、E51、I417、L98、I323、H161、T383、P127、E309、N84、L313、Q104、T371、N213、G79、L330、N307、K105、L128、A152、I18、N59、W147、S86、L293、E296、S377、L185、K216、F89、S286、F396、F211、Y303、D223、R415、N96、V22、S153、F154、D192、Y193、H195、P201、Y292和R322。 3.根据权利要求1所述的C-葡糖基转移酶变体，其中，所述氨基酸的突变包含氨基酸V93和Y193的突变。 4.根据权利要求1所述的C-葡糖基转移酶变体，其包含选自由F17G、V93Q、V132A、Y193F、L164G和R322D组成的组的至少一个氨基酸的置换。 5.根据权利要求3所述的C-葡糖基转移酶变体，其包含氨基酸V93Q和Y193F的置换。 6.根据权利要求2所述的C-葡糖基转移酶变体，进一步包含选自由以下组成的组的至少一个氨基酸的置换：F17G、V405M、P107G、L208G、L164G、P45G、I305A、L316G、F401H、Y94G、N57G、Y187A、C16G、P319G、F167G、V132A、N206E、R406G、Q386H、V129A、L125V、L194A、I95G、S215D、L184G、Y158T、L29A、L27A、F202S、H159G、S370A、H365G、V329T、M301W、V315A、V190A、C366G、W80Y、L58E、Q210G、F312G、D61G、I207P、L363G、P196G、L106G、V93G、A394G、W314C、S155A、P88D、D99G、Y284H、E189A、G49TH328G、E399D、T392A、F387T、A44G、P199E、E46G、R28G、V285I、I124T、R419A、L306M、Y157T、Y200L、E373A、P201G、P191G、L214A、S376G、V15G、E332P、E51C、I417L、L98G、I323A、H161G、T383C、P127A、E309N、N84S、L313T、Q104D、T371A、N213L、G79S、L330G、N307A、K105G、L128D、A152G、S153G、I18A、N59V、W147F、S86V、L293V、E296D、S377A、L185V、K216R、F89A、S286C、F396L、F211G、Y303A、D223G、R415L、N96A、V22H、V93Q、V93L、S153C、F154L、D192S、Y193F、H195Y、H195L、P201T、Y292H、Y292F、R322D和R322A。 7.根据权利要求4所述的C-葡糖基转移酶变体，进一步包含选自由I18P、Q20M、T50N、T50Q、T50K、T50R、T50V、I95M、I95T、V290G、V290A、I323S、I323A、I95L、V22A、L29A、E46G、V48G、E51C、A55S、S86V、D99G、R103V、C151G、L184G、L194A、E332P、I18A和P385A组成的组的至少一个氨基酸的置换。 8.根据权利要求7所述的C-葡糖基转移酶变体，进一步包含选自由I323S、T50R、T50V、I18P、I95T、Q20M、I323A、P385A、L194A和V48G组成的组的至少一个氨基酸的置换。 9.一种核酸，其编码根据权利要求1至8中任一项所述的变体。 10.一种重组微生物，其中导入根据权利要求9所述的核酸。 11.根据权利要求10所述的重组微生物，其中，在所述重组微生物中，编码UTP-葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶、磷酸葡萄糖变位酶和/或核苷-二磷酸激酶的基因的表达增强。 12.根据权利要求10所述的重组微生物，其中，所述重组微生物用于产生聚酮糖苷和/或苯丙素苷。 13.根据权利要求12所述的重组微生物，其中，将聚酮合酶或苯丙素合成酶进一步导入至所述重组微生物中。 14.根据权利要求12所述的重组微生物，其中，在所述重组微生物中，pabA基因的表达减弱。 15.根据权利要求12所述的重组微生物，其中，所述聚酮选自由以下组成的组： I型聚酮，其选自由雷帕霉素、洛伐他汀、红霉素、利福霉素、阿维菌素、格尔德霉素、伊维菌素、卡奇霉素、埃博霉素、三乙酸内酯和6-甲基水杨酸组成的组； II型聚酮，其选自由放线菌素、多柔比星、柔红霉素、土霉素、SEK4、SEK4b、SEK34、SEK15、SEK26、FK506、DMAC、阿克拉菌酮、阿克拉酸、ε-罗多新醌、多西环素、安曲霉素、特曲霉素、胭脂红酸和富伦菌素组成的组；以及 III型聚酮，其选自由芦荟素、芦荟宁、芦荟苷、5,7-二羟基-2-甲基色酮和芦荟松组成的组，以及 苯丙素类，其选自由以下组成的组：非核糖体，包括肽新福菌素、杆菌肽、达托霉素、万古霉素、泰斯巴汀、酪肽、短杆菌肽、双效菌素A、博来霉素、环孢素、pyoverdine、肠杆菌素、粘螯素A、靛玉苷和藻青素、乔松素、二氢莰非醇、圣草酚、二氢槲皮素、松柏醇、水飞蓟宾、异水飞蓟宾、水飞蓟亭、silinide、2,3-脱氢水飞蓟宾、水飞蓟宁、黄豆苷元、金雀异黄素、芹菜素、木犀草素、山奈酚、槲皮素、儿茶素、天竺葵素、花青素、阿夫儿茶素、杨梅素、非瑟酮、高良姜素、橙皮素、桔皮素、飞燕草素、表儿茶素、白杨素、白藜芦醇和柚皮素。 16.根据权利要求12所述的重组微生物，其中，导入选自由以下组成的组的至少一个基因：(i)编码II型聚酮合酶的基因，(ii)编码4'-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的基因，(iii)编码环化酶的基因，(iv)编码乙酰-CoA羧化酶的基因，和(v)编码阿克拉菌酮12-羟化酶的基因，并且所述聚酮糖苷是胭脂红酸。 17.根据权利要求16所述的重组微生物，其中，所述编码II型聚酮合酶的基因是选自由antD(酮合酶)、antE(链长因子)、antF(ACP)、antB(磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶)和antG(丙二酰-CoA：ACP丙二酰转移酶)组成的组的至少一个；或其组合。 18.根据权利要求16所述的重组微生物，其中，所述阿克拉菌酮12-羟化酶在SEQ IDNO:2所示的氨基酸序列中的氨基酸第217位处包含从脯氨酸到赖氨酸的突变(P217K)。 19.根据权利要求16所述的重组微生物，其中： 所述II型聚酮合酶源自发光光杆状菌(P.luminescens)； 所述4'-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶源自枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)或发光光杆状菌(P.luminescens)； 所述环化酶源自链霉菌属(Streptomyces sp.)； 所述乙酰-CoA羧化酶源自谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)；和/或 所述阿克拉菌酮12-羟化酶源自波赛链霉菌(Streptomycespeucetius)。 20.根据权利要求12所述的重组微生物，其中,(i)导入编码芦荟松合酶的基因，并且所述聚酮糖苷是芦荟素。 21.根据权利要求20所述的重组微生物，其中，所述芦荟松合酶源自掌叶大黄。 22.一种产生聚酮糖苷和/或苯丙素苷的方法，其包括： (a)通过培养根据权利要求10所述的重组微生物来产生聚酮糖苷和/或苯丙素苷；和 (b)回收产生的聚酮糖苷和/或苯丙素苷。 23.根据权利要求22所述的方法，其中，所述重组微生物具有产生所述聚酮糖苷和/或所述苯丙素苷的前体的能力。 24.根据权利要求22所述的方法，其中，步骤(a)包括在补充有聚酮和/或苯丙素类的培养基中培养根据权利要求10所述的重组微生物。 25.根据权利要求22所述的方法，其中，所述聚酮糖苷是胭脂红酸，并且在步骤(a)中，通过在培养过程中向培养基中添加抗坏血酸来培养所述微生物。 26.一种产生聚酮糖苷和/或苯丙素苷的方法，其包括： (a)通过使根据权利要求1至8中任一项所述的C-葡糖基转移酶变体或表达所述C-葡糖基转移酶变体的微生物与聚酮和/或苯丙素类反应来产生聚酮糖苷和/或苯丙素苷；以及 (b)回收产生的聚酮糖苷和/或苯丙素苷。