12个小核酸同管联合扩增检测方法与试剂盒
本发明提供了12个小核酸同管联合扩增检测方法与试剂盒，利用12个特异主探针、12个特异辅探针和1个通用锚探针，从样本中杂交捕获miR‑10b‑3p、miR‑214、miR‑196a、miR‑761、miR‑602、miR‑522、miR‑935、miR‑765、miR‑205、miR‑1178、miR‑638肿瘤相关小核酸和1个内参小核酸miR‑let7a，再以绿豆核酸酶去除没有结合靶标小核酸的主探针，已捕获靶标小核酸的主探针保持完整可被荧光定量PCR扩增检测，阳性扩增Ct值指示肿瘤相关小核酸的存在，整合熔解曲线分析Tm峰指示内参扩增。基于本发明方法的试剂盒组成包含：样本释放剂、磁珠液、洗涤液、绿豆核酸酶液、PCR液、阳性对照等组分，可实现一管体系同步检测上述11个肿瘤相关小核酸和1个内参小核酸，有利于检测应用。
发明专利
CN202211318419.2
2022-10-26
CN115992239A
2023-04-21
C12Q1/6886(2018.01)
浙江今复康生物科技有限公司
徐逸丽;陈燃
310000 浙江省杭州市滨江区西兴街道江陵路88号8幢11楼、1楼106室
杭州裕阳联合专利代理有限公司
金方玮
浙江;33
1.12个小核酸同管联合扩增检测方法，其特征在于，所述检测方法包括：利用12个特异主探针、12个特异辅探针和1个通用锚探针，从样本中杂交捕获11个肿瘤相关小核酸和内参小核酸，再以绿豆核酸酶体系去除没有结合靶标小核酸的特异主探针，捕获靶标小核酸的特异主探针保持完整可被PCR扩增检测，阳性扩增Ct值指示肿瘤相关小核酸的存在； 其中，所述肿瘤相关小核酸为miR-10b-3p、miR-214、miR-196a、miR-761、miR-602、miR-522、miR-935、miR-765、miR-205、miR-1178与miR-638，所述内参小核酸为miR-let7a。 2.根据权利要求1所述的12个小核酸同管联合扩增检测方法，其特征在于，所述12个特异主探针序列组成为：两端为通用序列，中间为额外添加的核苷酸序列加靶标小核酸特异互补序列，使得11个肿瘤相关小核酸特异主探针的Tm值比内参小核酸特异主探针的Tm值高8-12℃。 3.根据权利要求1所述的12个小核酸同管联合扩增检测方法，其特征在于，PCR程序荧光读取温度设置在比肿瘤相关小核酸特异主探针的Tm值小3-6℃，比内参特异主探针的Tm值高3-6℃，使得扩增曲线和Ct值为源自肿瘤相关小核酸的扩增，而排除源自内参的扩增。 4.根据权利要求1所述的12个小核酸同管联合扩增检测方法，其特征在于，阳性扩增熔解曲线有2个Tm相差8-12℃的峰；其中，Tm值低于扩增荧光读取温度3-6℃的峰，指示源自内参的扩增。 5.根据权利要求1-4任一项所述的12个小核酸同管联合扩增检测方法，其特征在于，所述特异主探针的序列依次如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.12所示，所述特异辅探针的序列依次如SEQ ID NO.13～SEQ ID NO.24所示，所述通用锚探针的序列如SEQ ID NO.27所示。 6.根据权利要求1-4任一项所述的12个小核酸同管联合扩增检测方法，其特征在于，所述检测方法具体为： 1)样本采集； 2)裂解杂交； 3)吸附，洗涤，酶切与再洗涤； 4)PCR反应与熔解曲线分析； 其中，PCR程序为：95℃10min预变性后，再40个循环的94℃6s、62℃30s、80℃34s，荧光读取温度设定在80℃。 7.根据权利要求6所述的12个小核酸同管联合扩增检测方法，其特征在于，步骤4)中，熔解曲线分析的结果判断为：熔解曲线在80℃前有Tm峰，指示内参质控合格，结果可靠；Ct值<37，指示阳性，代表肿瘤相关小核酸有扩增；Ct值≥37或No Ct，指示阴性，代表肿瘤相关小核酸无扩增。 8.12个小核酸同管联合扩增检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：1×样本释放剂、1×磁珠液、10×洗涤液、1×绿豆核酸酶液、1×PCR液与1×阳性对照，可在一管反应体系中同步检测肿瘤相关小核酸miR-10b-3p、miR-214、miR-196a、miR-761、miR-602、miR-522、miR-935、miR-765、miR-205、miR-1178与miR-638和内参小核酸miR-let7a；所述样本释放剂包括权利要求1-7任一项所述的特异主探针、特异辅探针和通用锚探针，所述PCR液包括上下游引物，所述上游引物的序列如SEQ ID NO.25所示，所述下游引物的序列如SEQ IDNO.26所示。 9.根据权利要求8所述的12个小核酸同管联合扩增检测试剂盒，其特征在于，所述样本释放剂的组成为：42nM各特异主探针、42nM各特异辅探针、504nM通用锚探针、60mM氯化锌、60mM乙酸钠、60mM半胱氨酸、15％碳酸亚乙酯、6％十二烷基硫酸钠与6％聚乙二醇6000；绿豆核酸酶液的组成为pH5.0的50mM乙酸钠缓冲液中含有30mM氯化钠、1mM氯化锌与0.04U/μL绿豆核酸酶。